UnkontrollierteZellproliferation wird für eine breite Anzahl von Gesundheitsstörungen,die von Krebs- bis hin zu immunproliferativen Krankheiten reichen,verantwortlich gemacht. Beispielsweise ist Krebs in den USA dieHaupttodesursache eines weitaus größeren Bevölkerungsanteilsals Herzerkrankungen (Journal of the National Cancer Institute,Vol. 97, Nr. 5, 2. März, 2005, S. 330) und trägtzu mehr als 500.000 Todesfällen im Jahr bei. Trotz Jahrzehntenvon Forschungsarbeit in diesem Bereich bleibt die Behandlung vonZellproliferationskrankheiten weiter eine Herausforderung.
DieWirksamkeit therapeutischer Verfahren zur Krebsbekämpfung,wie etwa operative Eingriffe oder Chemotherapie, sind auch heutenoch begrenzt; hinzu kommen Nebenwirkungsprofile und Kosten. Insbesonderedie Wirksamkeit und Anwendbarkeit der verfügbaren therapeutischenOptionen ist in hohem Maße von der spezifischen Tumorartund der Art der Erkrankung abhängig. Es besteht daher einBedarf für Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlungvon Zellproliferationsstörungen und anderen Krankheiten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNGDieseErfindung bezieht sich auf diesen und auf andere Bedarfsbereiche.Die Erfindung sieht Zusammensetzungen und Behandlungsverfahren vor,die auf der überraschenden Erkenntnis basieren, dass gewisse peptidomimetischeMakrocyclen beim Einsatz zur Behandlung proliferativer Störungenunerwartete Spezifizität, Wirksamkeit und Wirkungsstärkezeigen.
Ineiner Hinsicht bietet diese Erfindung ein Verfahren zur Behandlungvon Krebserkrankungen beim Menschen, der einer solchen Behandlungbedarf und sieht die Verabreichung eines peptidomimetischen Makrocyclusan den Patienten vor, wobei der Krebs aus einer Gruppe bestehendaus den folgenden Krebserkrankungen ausgewählt ist: kleinzelligerLungenkrebs, Hautkrebs (Melanom), Eierstockkrebs, Prostatakrebs,Nierenkrebs, Brustkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs und Ph+akute lymphatische Leukämie (Ph+ ALL). In einer Ausführungsformbesitzt der peptidomimetische Makrocyclus eine α-Helix.In einer anderen Ausführungsform besitzt der peptidomimetischeMakrocyclus eine BH3-Domäne. Der peptidomimetische Makrocycluskann beispielsweise ein BIM-Polypeptid sein. In manchen Fällenist eine Aminosäuresequenz des BIM-Polypeptids zu mehrals 60% mit einer Aminosäuresequenz IWIAQELR*IGD*FNAYYARRidentisch, wobei * eine getetherte Aminosäure ist. In anderenFällen ist eine Aminosäuresequenz des BIM-Polypeptidszu mehr als 80% mit einer Aminosäuresequenz IWIAQELR*IGD*FNAYYARRidentisch, wobei * eine getetherte Aminosäure ist. Weiter kanneine Aminosäuresequenz des besagten BIM-Polypeptids zumehr als 95% mit einer Aminosäuresequenz IWIAQELR*IGD*FNAYYARRidentisch sein, wobei * eine getetherte Aminosäure ist.In manchen Ausführungsformen reagiert der Krebs mindestensum das Zweifache weniger sensitiv auf Behandlungen, die ein entsprechendesquervernetztes BID-Polypeptid verwenden, wie im In-vitro-Assay zurZellentwicklungsfähigkeit gemessen wurde. In anderen Ausführungsformenreagiert der Krebs mindestens um das Fünffache wenigersensitiv auf Behandlungen, die ein entsprechendes quervernetztesBID-Polypeptid verwenden, wie im In-vitro-Assay zur Zellentwicklungsfähigkeitgemessen wurde. In weiteren Ausführungsformen reagiertder Krebs mindestens um das Achtfache weniger sensitiv auf Behandlungen,die ein entsprechendes quervernetztes BID-Polypeptid verwenden,wie im In-vitro-Assay der Zellentwicklungsfähigkeit gemessenwurde.
Inausgewählten Ausführungsformen handelt es sichbei der Krebserkrankung um Brustkrebs, beispielsweise ein invasivesBrustkarzinom wie etwa ein invasives Drüsengangskarzinom.In anderen Fällen handelt es sich bei der Krebserkrankungum Prostatakrebs. In weiteren Ausführungsformen handeltes sich bei der Krebserkrankung um Eierstockkrebs. In einerweiterenAusführungsform handelt es sich bei bei der Krebserkrankungum Bauchspeicheldrüsenkrebs. In weiteren Ausführungsformenhandelt es sich bei der Krebserkrankung um Nierenkrebs. In anderenFällen handelt es sich bei der Krebserkrankung um Ph+ akute lymphatischeLeukämie (Ph+ ALL).
DieErfindung stellt zudem ein Verfahren zur Behandlung von Krebserkrankungenbeim Menschenr, der einer solchen Behandlung bedarf bereit und siehtdie Verabreichung eines peptidomimetischen Makrocyclus an den Patientenvor, wobei es sich bei der Krebserkrankung um Darmkrebs handelt.In einer Ausführungsform besitzt der peptidomimetischeMakrocyclus eine α-Helix. In einer anderen Ausführungsformbesitzt der peptidomimetische Makrocyclus eine BH3-Domäne.Der peptidomimetische Makrocyclus kann beispielsweise ein BID-Polypeptidsein. In manchen Fällen ist eine Aminosäuresequenzdes BID-Polypeptids zu mehr als 60% mit einer Sequenz DIIRNIARHLA*VGD*NleDRSIidentisch, wobei * eine getetherte Aminosäure und Nle Norleucinist. In anderen Fällen ist eine Aminosäuresequenzdes BID-Polypeptids zu mehr als etwa 80% mit einer Sequenz DIIRNIARHLA*VGD*NleDRSIidentisch, wobei * eine getetherte Aminosäure und Nle Norleucinist. Weiter kann eine Aminosäuresequenz des besagten BID-Polypeptidszu mehr als 95% mit einer Sequenz DIIRNIARHLA*VGD*NleDRSI identischsein, wobei * eine getetherte Aminosäure und Nle Norleucinist. In manchen Ausführungsformen reagiert der Krebs mindestensum das Zweifache weniger sensitiv auf Behandlungen, die ein entsprechendesquervernetztes BIM-Polypeptid verwenden, wie im in vitro Assay zurZellentwicklungsfähigkeit gemessen wurde. In anderen Ausführungsformenreagiert der Krebs mindestens um das Fünffache wenigersensitiv auf Behandlungen, die ein entsprechendes quervernetztesBIM-Polypeptid verwenden, wie im in vitro Assay zur Zellentwicklungsfähigkeitgemessen wurde. In weiteren Ausführungsformen reagiertder Krebs mindestens um das Achtfache weniger sensitiv auf Behandlungen,die ein entsprechendes quervernetztes BIM-Polypeptid verwenden,wie im in vitro Assay zur Zellentwicklungsfähigkeit gemessenwurde.
Weiterstellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Krebserkrankungenbeim Menschen, der einer solchen Behandlung bedarf, bereit, dasdie Verabreichung eines peptidomimetischen Makrocyclus an den Patientenvorsieht, wobei der besagte peptidomimetische Makrocyclus einenEC50-Wert aufweist, der bei Tests in einemin vitro Assay zur Zellentwicklungsfähigkeit im Vergleichzu dem Wert einer vom Krebs abgeleiteten Zelllinie unter etwa 5 μMliegt. In manchen Ausführungsformen kann EC50 niedrigerals etwa 4 μM sein. In anderen Ausführungsformenkann EC50 niedriger etwa 3 μM sein.In weiteren Ausführungsformen kann EC50 niedrigerals etwa 2 μM sein. In anderen Ausführungsformenkann EC50 niedriger als etwa 1 μMsein. In manchen Ausführungsformen wird der In-vitro-Assayin der Gegenwart von Serum durchgeführt. Beispielsweise kannder Assay in 10% Humanserum durchgeführt werden. In mancherHinsicht wird der Krebs aus einer Gruppe ausgewählt, dieaus folgenden Krebserkrankungen besteht: Eierstockkrebs, Hautkrebs,Prostatakrebs, Nierenkrebs, Brustkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs,kleinzelliger Lungenkrebs, Darmkrebs, Multiples Myelom, Burkitt-Lymphom,akute lymphatische Leukämie (ALL) der T-Zelllinie oderB-Zelllinie oder gemischter Linien, chronische lymphatische Leukämie(CLL), kutanes T-Zell-Lymphom (CTCL), akute myelozytische Leukämie (AML),chronische myelozytische Leukämie und follikuläresLymphom.
Ineiner Hinsicht stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Behandlungvon Krebserkrankungen beim Menschen, der einer solchen Behandlungbedarf, bereit, das die Verabreichung eines peptidomimetischen Makrocyclusan den Patienten vorsieht, wobei der Krebs aus einer Gruppe bestehendaus den folgenden Krebserkrankungen ausgewählt ist: Eierstockkrebs,Prostatakrebs, Nierenkrebs, Brustkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebsund Ph+ akute lymphatische Leukämie. In einer Ausführungsformbesitzt der peptidomimetische Makrocyclus eine α-Helix.In einer anderen Ausführungsform besitzt der peptidomimetischeMalcrocyclus eine BH3-Domäne. Der peptidomimetische Makrocycluskann beispielsweise ein BIM-Polypeptid sein. In manchen Fällenist eine Aminosäuresequenz des BIM-Polypeptids zu mehrals 60% mit einer Aminosäuresequenz IWIAQELR*IGD*FNAYYARRidentisch, wobei * eine getetherte Aminosäure ist. In anderenFällen ist eine Aminosäuresequenz des BIM-Polypeptidszu mehr als 80% mit einer Aminosäuresequenz IWIAQELR*IGD*FNAYYARRidentisch, wobei * eine getetherte Aminosäure ist. Weiterkann eine Sequenz des besagten BIM-Polypeptids zu mehr als 95% miteiner Aminosäuresequenz IWIAQELR*IGD*FNAYYARR identischsein, wobei * eine getetherte Aminosäure ist.
Inmanchen Ausführungsformen wird der Krebs aus einer Gruppeausgewählt, die aus folgenden Krebserkrankungen besteht:Darmkrebs, kleinzelliger Lungenkrebs, Leberkrebs, Eierstockkrebs,Hautkrebs, Prostatakrebs, Nierenkrebs, Brustkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs,Gliom, Multiples Myelom, Burkitt-Lymphom, akute lymphatische Leukämie(ALL) der T-Zelllinie oder B-Zelllinie oder gemischter Linie, chronische lymphatischeLeukämie (CLL), kutanes T-Zell-Lymphom (CTCL), akute myelozytischeLeukämie (AML), chronische myelozytische Leukämieund follikuläres Lymphom. In einer Ausführungsformbesitzt der peptidomimetische Makrocyclus eine α-Helix.In einer anderen Ausführungsform besitzt der peptidomimetischeMakrocyclus eine BH3-Domäne. Bei dem peptidomimetischenMakrocyclus kann es sich beispielsweise um ein BID-Polypeptid handeln.In manchen Fällen ist eine Aminosäuresequenz desBID-Polypeptids zu mehr als etwa 60% mit einer Sequenz DIIRNIARHLA*VGD*NleDRSIidentisch, wobei * eine getetherte Aminosäure und Nle Norleucinist. In anderen Fällen ist eine Aminosäuresequenzdes BID-Polypeptids zu mehr als etwa 80% mit einer Sequenz DIIRNIARHLA*VGD*NleDRSIidentisch, wobei * eine getetherte Aminosäure und Nle Norleucinist. Weiter kann eine Aminosäure des besagten BID-Polypeptidszu mehr als etwa 95% mit einer Sequenz DIIRNIARHLA*VGD*NleDRSI identischsein, wobei * eine getetherte Aminosäure und Nle Norleucinist.
DieseErfindung stellt zudem ein Verfahren zur Behandlung einer Gesundheitsstörungbeim Menschen, der einer solchen Behandlung bedarf, bereit, dasdie Verabreichung eines peptidomimetischen Makrocyclus an den Patientenvorsieht, bestehend aus a) der Zubereitung eines peptidomimetischenMakrocycleus, indem eine Quervernetzung zwischen zwei Aminosäureresteneines Polypeptids eingefügt wird; b) der Testung des peptidomimetischenMakrocyclus hinsichtlich Vorliegen oder Fehlen einer immunogenenReaktion; und c) der Verabreichung des peptidomimetischen Makrocyclusan einen Patienten, wenn die besagte immunogene Reaktion keine erheblicheNebenwirkung hervorruft. Die Nicht-Immunogenität kann sichals minimale Antiköperreaktion in einem In-vivo-Assay beiNagetieren, wie beispielsweise in der Maus, im nicht-menschlichenPrimaten oder im Menschen, niederschlagen. Bei der Verabreichungan einen Menschen induziert eine nicht immunogene Verbindung mitBezug auf die verbindungseigene Immunogenität möglicherweisekeine erheblichen oder nur geringe Nebenwirkungen beim Patienten.Bei der Gesundheitsstörung kann es sich um eine Krebserkrankung,eine Stoffwechselkrankheit, eine Herzkreislauferkrankung, eine entzündlicheoder eine degenerative Krankheit handeln. In einer Ausführungsformbesitzt der peptidomimetische Makrocyclus eine α-Helix.In einer anderen Ausführungsform besitzt der peptidomimetischeMakrocyclus eine BH3-Domäne. Der peptidomimetische Makrocycluskann beispielsweise ein BID-Polypeptid sein. In manchen Fällenist eine Aminosäuresequenz des BID-Polypeptids zu mehrals etwa 60% mit einer Sequenz DIIRNIARHLA*VGD*NleDRSI identisch,wobei * eine getetherte Aminosäure und Nie Norleucin ist.In anderen Fällen kann eine Aminosequenz des BID-Polypeptidszu mehr als etwa 80% mit einer Sequenz DIIRNIARHLA*VGD*NleDRSI identisch sein,wobei * eine getetherte Aminosäure und Nle Norleucin ist.Weiter kann eine Aminosäuresequenz des besagten BID-Polypeptidszur mehr als etwa about 95% mit einer Sequenz DIIRNIARHLA*VGD*NleDRSIidentisch sein, wobei * eine getetherte Aminosäure undNle Norleucin ist. Der peptidomimetische Makrocyclus kann auch beispielsweiseein BIM-Polypeptid sein. In manchen Fällen ist eine Aminosäuresequenzdes BIM-Polypeptids zur mehr als etwa 60% mit einer AminosäuresequenzIWIAQELR*IGD*FNAYYARR identisch, wobei * eine getetherte Aminosäureist. In anderen Fällen ist die Aminosäuresequenzdes BIM-Polypeptids zu mehr als etwa 80% mit einer AminosäuresequenzIWIAQELR*IGD*FNAYYARR identisch, wobei * eine getetherte Aminosäureist. Weiter kann ein Aminosäuresequenz des besagten BIM-Polypeptidszu mehr als etwa 95% mit einer Aminosäuresequenz IWIAQELR*IGD*FNAYYARRidentisch sein, wobei * eine getetherte Aminosäure ist.
Inanderer Hinsicht stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlungvon immunproliferativen Störungen beim Menschen, der einersolchen Behandlung bedarf, bereit, das die Verabreichung eines peptidomimetischenMakrocyclus an den Patienten vorsieht. Der peptidomimetische Makrocyclusreduziert eine aktivierte hPBL-Proliferation möglicherweiseum mehr als etwa 5%, 10%, 20%, 30%, 40% oder 50% in einem In-vitro-BrdU-Inkorporationsassay.Bei der immunproliferativen Krankheit kann es sich beispielsweiseum eine lymphoproliferative Erkrankung oder eine Autoimmunkrankheit,wie beispielsweise Lupus erythematodes, handeln. Bei dem peptidomimetischenMakrocyclus kann es sich beispielsweise um ein BID-Polypeptid handeln. Inmanchen Fällen ist eine Aminosäuresequenz einesBID-Polypeptids zur mehr als etwa 60% mit einer Sequenz DIIRNIARHLA*VGD*NleDRSIidentisch, wobei * eine getetherte Aminosäure und Nle Norleucinist. In anderen Fällen kann eine Aminosäuresequenzdes BID-Polypeptids zu mehr als etwa 80% mit einer Sequenz DIIRNIARHLA*VGD*NleDRSIidentisch sein, wobei * eine getetherte Aminosäure undNle Norleucin ist. Weiter kann eine Aminosäuresequenz desbesagten BID-Polypeptids zu mehr als 95% mit einer Sequenz DIIRNIARHLA*VGD*NleDRSIidentisch sein, wobei * eine getetherte Aminosäure undNle Norleucin ist. Bei dem peptidomimetischen Makrocyclus kann essich auch beispielsweise um ein BIM-Polypeptid handeln. In manchen Fällenist eine Aminosäuresequenz des BIM-Polypeptids zu mehrals etwa 60% mit einer Aminosäuresequenz IWIAQELR*IGD*FNAYYARRidentisch, wobei * eine getetherte Aminosäure ist. In anderenFällen ist die Aminosäuresequenz des BIM-Polypeptidszu mehr als etwa 80% mit einer Aminosäuresequenz IWIAQELR*IGD*FNAYYARRidentisch, wobei * eine getetherte Aminosäure ist. Weiterkann eine Aminosäuresequenz des besagten BIM-Polypeptidszu mehr als etwa 95% mit einer Aminosäuresequenz IWIAQELR*IGD*FNAYYARRidentisch sein, wobei * eine getetherte Aminosäure ist.
Fürjeden beliebigen der peptidomimetischen Makrocyclen, die vorstehendoffengelegt werden, kann ein α-Kohlenstoffatom in dem besagtenpeptidomimetischen Makcrocyclus zusätzlich mit unabhängigenSubstituenten der Formel R-substituiert werden, wobei R- fürAlkyl, Alkenyl, Alkinyl, Arylalkyl, Cycloalkylalkyl, Heteroalkyloder Heterocycloalkyl, unsubstituiert oder mit Halo-substituiert,steht. In manchen Ausführungsformen wird ein α-Kohlenstoffatom,an das der Vernetzer angehängt ist, zusätzlichmit einem Substituenten der Formel R-substituiert. In einer anderenAusführungsform wird ein α-Kohlenstoffatom, andem der Vernetzer nicht angehängt ist, zusätzlichmit einem Substituenten der Formel R-substituiert. In anderen Fällenwerden zwei α-Kohlenstoffatome in einem peptidomimetischenMakrocyclus zusätzlich mit unabhängigen Substituentender Formel R-substituiert. In manchen Ausführungsformenwerden zwei α-Kohlenstoffatome, an die der Vernetzer angehängtist, zusätzlich mit unabhängigen Substituentender Formel R-substituiert. In anderen Ausführungsformenwerden zwei α-Kohlenstoffatome, an die der Vernetzer nichtangehängt ist, zusätzlich mit unabhängigenSubstituenten der Formel R-substituiert. R- kann beispielsweisefür Alkyl stehen, wie Methyl, Ethyl, Propyl oder Isopropyl.Der Vernetzer kann zwei α-Kohlenstoffatome verbinden. Inmanchen Ausführungsformen bilden R- und ein beliebigerTeil des Vernetzers zusammengenommen eine cyclische Struktur. In anderenAusführungsformen wird der Vernetzer durch konsekutiveKohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen gebildet. In weiteren Ausführungsformenenthält der Vernetzer etwa 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 oder13 konsekutive Bindungen. In weiteren Ausführungsformenbesteht der Vernetzer aus mindestens 5, 6, 7, 8 oder 9 Kohlenstoffatomen.
DieErfindung stellt weiter ein Verfahren zu Behandlung von Krebserkrankungenbeim Menschen, der einer solchen Behandlung bedarf, bereit, beidem die Verabreichung eines peptidomimetischen Makrocyclus an denPatienten vorgesehen ist, wobei der besagte peptidomimetische Makrocycluswechselseitig auf Mcl-1 einwirkt. In manchen Ausführungsformenwirkt der peptidomimetische Makrocyclus der Interaktion zwischen Mcl-1und pro-apoptotischen Proteinen wie BID, BIM, BAX oder BAK entgegen.In anderen Ausführungsformen werden die erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen zur Krebsbehandlung beim Menschen insolchen Fällen verwendet, wenn der Krebs mit Bezug aufABT-737 oder einem Analog davon resistent ist oder in Fällen,wenn der Krebs mit Bezug auf eine Verbindung mit einer Affinitätvon größer 1, 2, 5 oder 10 μM mit BezugMcl-1 resistent ist.
DieErfindung stellt weiter ein Verfahren zur Behandlung von ABT-737-resistentemkleinzelligem Lungenkrebs beim Menschen, der einer solchen Behandlungbedarf, bereit, das die Verabreichung eines peptidomimetischen Makrocyclusan den Patienten vorsieht, wobei der peptidomimetische Makrocycluseine BH3-Domäne besitzt. Die Erfindung stellt weiter einVerfahren zur Behandlung von Prostatakrebs beim Menschen, der einersolchen Behandlung bedarf, bereit, das die Verabreichung eines peptidomimetischenMakrocyclus an den Patienten vorsieht, wobei der peptidomimetischeMakrocyclus eine BH3-Domäne besitzt.
Beijedem beliebigen der hier angezeigten Behandlungsverfahren wirdder peptidomimetische Makrocyclus als Teil des Behandlungsstandardsverabreicht. Der Behandlungsstandard kann beispielsweise Chemotherapiesein. In anderen Fällen kann der Behandlungsstandard eineBestahlungstherapie sein. In einem weiteren Ausführungsformist die standardgemäße Patientenversorgung einoperativer Eingriff.
IM VORLIEGENDEN DURCH BEZUGNAHME AUFGENOMMENAlleVeröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen, dieim Rahmen dieser Patentschrift erwähnt werden, werden durchBezugnahme hierin aufgenommen, insbesondere insoweit als sei aufjede einzelne Veröffentlichung, jedes einzelne Patent oderjede einzelne Patentanmeldung speziell und im Einzelnen dahingehendhingewiesen und gesagt worden, dass sie im Vorliegenden durch Bezugnahmeaufgenommen werden.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGENDieneuartigen Merkmale der Erfindung sind in den nachstehenden Ansprüchenfestgehalten. Ein besseres Verständnis der Merkmale undVorteile dieser Erfindung erhält man durch Bezugnahme aufdie folgende detaillierte Beschreibung, in der Ausführungsformenzur Veranschaulichung im Einzelnen dargestellt und die Prinzipiender Erfindung verwertet wurden, sowie in den begleitenden Zeichnungen.In diesem Zusammenhang gilt:
1 zeigtdie Sensitivität von 24 verschiedenen Tumorzelllinien hinsichtlichBehandlung mit 20 μM SP-1.
2 zeigtdie Sensitivität von 7 menschlichen Leukämie-/Lymphomzelllinienhinsichtlich Behandlung mit 5 μM von entweder SP-1 oderSP-4.
3 zeigtdie Sensitivität von 12 menschlichen soliden Tumor[zell]linienhinsichtlich Behandlung mit 20 μM von entweder SP-1 oderSP-4.
4 zeigtdie EC50-Kurven für SP-1 oder SP-4,jeweils gegen verschiedene Zelllinien getestet.
5–15 beschreibendie EC50-Kurven für SP-1, SP-2,SP-3, SP-4, SP-5 und SP-6, jeweils gegen mehrere individuelle Zellliniengetestet.
16 zeigt, dass SP-1 nicht den programmierten Zelltodruhender menschlicher-peripherer Lymphozyten (hPBLs) induziert.
17 ist eine beispielhafte Darstellung dessen,dass SP-1 bei der Blockierung der Proliferation von hPBLs, die durchdie Behandlung mit PMA + Ionomycin + LPS aktiviert wurden, genausoeffektiv ist wie Rapamycin.
18–19 zeigen,dass SP-1 die Tumorlast in einem SEMK2-Leukämie-Xenotransplantationsmodellbeim Menschen verringert.
20 zeigt, dass SP-1 keine Antikörperreaktionbei Nagetieren hervorruft.
21 demonstriert, dass SP-1 im hohen Maßestabil ist und auch bei einem Temperaturanstieg auf bis zu 64°Cseine helikale Konformation beibehält.
22 beschreibt die Plasmastabilität beimMenschen bei einer Reihe von erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen.
23 beschreibt die Plasmastabilität inder Maus bei einer Reihe von erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen.
24 zeigt die pharmakokinetischen Eigenschaftenvon SP-1 und SP-4 bei der Ratte.
25 beschreibt die Induzierung von programmiertemZelltod bei Jurkat-Tumorzellen, jeweils herbeigeführt durchdie erfindungsgemäßen peptidomimetischen Makrocyclenohne Vorliegen von Humanserum; weiter wird die Wirkstärkevon erfindungsgemäßen BH3-peptidomimetischen Makrocyclenmit BCL-2/BCL-XL-spezifischen Antagonisten, wie ABT-737, verglichen.
26 beschreibt die Induzierung von programmiertemZelltod bei Jurkat-Tumorzelllinien durch die erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen bei Vorliegen von 10% Humanserum;weiter wird die Wirkstärke von erfindungsgemäßenBH3-peptidomimetischen Makrocyclen mit BCL-2/BCL-XL-spezifischen Antagonisten,wie ABT-737 verglichen.
27 vergleicht die Bindungsaffinität mehrerererfindungsgemäßer BH3-peptidomimetischer Makrocyclenund von ABT-737 an Bcl-XL, Bcl-2 und Mcl-1.
28 zeigt die Wirksamkeit von peptidomimetischenMakrocyclen im Hinblick auf eine Anzahl von hematologischen Malignitäten.
29 veranschaulicht das unterschiedliche Proteinexpressionsprofilder Bcl-2-Familie von Zelllinien, die für die erfindungsgemäßeZusammensetzung sensitiv sind.
30 vergleicht die Wirksamkeit von peptidomimetischenMakrocyclen mit ABT-737 in Raji, einer ABT-737-resistenten Zellliniedes Burkitt-Lymphoms.
31 veranschaulicht die Wirksamkeit von BH3-peptidomimetischenMakrocyclen hinsichtlich einer Vielzahl solider Tumorzelllinien.
32 demonstriert die Induzierung vom programmiertenZelltod durch einen erfindungsgemäßen peptidomimetischenMakrocyclus bei einer ABT-737-resistenten Zellinie eines kleinzelligenLungenkrebses (NCI-H82).
33 zeigt die Suppression der SEMK-2-Tumorprogressionbei der NOD-SCID-Maus durch erfindungsgemäße Verbindungen.
34 beschreibt die Induzierung vom programmiertenZelltod durch erfindungsgemäße peptidomimetischeMakrocyclen bei einer Zellinie eines Eierstocktumors (OVCAR8), Behandlungohne Vorliegen von Serum.
35 demonstriert die Induzierung vom programmiertenZelltod durch erfindungsgemäße peptidomimetischeMakrocyclen bei einer Zellinie eines Eierstocktumors (OVCAR8), Behandlungbei Vorliegen in 2% Humanserum.
36 demonstriert die Induzierung vom programmiertenZelltod durch erfindungsgemäße peptidomimetischeMakrocyclen bei einer Zelllinie eines Melanoms (A375), Behandlungohne Vorliegen von Serum.
37 demonstriert die Induzierung vom programmiertenZelltod durch erfindungsgemäße peptidomimetischeMakrocyclen bei einer Zelllinie eines Melanoms (A375), Behandlungbei Vorliegen in 2% Humanserum.
38 demonstriert die Induzierung vom programmiertenZelltod durch erfindungsgemäße peptidomimetischeMakrocyclen bei einer Zelllinie eines Brustkrebstumors (MDA-MD-231-Met),Behandlung ohne Vorliegen von Serum.
39 demonstriert die Induzierung vom programmiertenZelltod durch erfindungsgemäße peptidomimetischeMakrocyclen bei einer Zelllinie eines Brustkrebstumors (MDA-MD-231-Met),Behandlung bei Vorliegen in 2% Humanserum.
40 demonstriert die Induzierung vom programmiertenZelltod durch erfindungsgemäße peptidomimetischeMakrocyclen bei einer Zelllinie eines Prostatakrebstumors (PC3),Behandlung ohne Vorliegen von Serum.
41 demonstriert die Induzierung vom programmiertenZelltod durch erfindungsgemäße peptidomimetischeMakrocyclen bei einer Zelllinie eines Prostatakrebstumors (PC3),Behandlung bei Vorliegen in 2% Humanserum.
42 demonstriert die Induzierung vom programmiertenZelltod durch erfindungsgemäße peptidomimetischeMakrocyclen bei einer Zelllinie eines kleinzelligen Lungenkrebes(NCI-H-82), Behandlung ohne Vorliegen von Serum.
43 demonstriert einen Western Blot, auf dem verschiedeneExpressionen unterschiedlicher Proteine der BCL-Familie bei Krebserkrankungendargestellt sind, die sensitiv auf die erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen reagieren.
44 demonstriert einen zeitlichen Behandlungsablaufbei der Maus im Rahmen eines orthotopischen Xenotransplantationsmodellsbei Prostatakrebs.
45 demonstriert die Wirksamkeit des erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclus im Rahmen eines orthotopischen Xenotransplantationsmodellsbei Prostatakrebs.
46 beschreibt die Induzierung vom programmiertenZelltod durch die erfindungsgemäßen peptidomimetischenMakrocyclen bei einer T-Zellen-Leukämiezelllinie (Jurkat),Behandlung ohne Vorliegen von Serum.
47 beschreibt die Induzierung vom programmiertenZelltod durch die erfindungsgemäßen peptidomimetischenMakrocyclen bei einer gemischten T/B-Zellen-Leukämiezelllinie(SEMK2), Behandlung ohne Vorliegen von Serum.
48 beschreibt die Induzierung vom programmiertenZelltod durch die erfindungsgemäßen peptidomimetischenMakrocyclen bei einer T-Zellen-Leukämiezelllinie (MOLT-4),Behandlung ohne Vorliegen von Serum.
49 beschreibt die Induzierung vom programmiertenZelltod durch die erfindungsgemäßen peptidomimetischenMakrocyclen bei einer diffusen großen B-Zellen-Lymphomzelllinie(DHL-6), Behandlung ohne Vorliegen von Serum.
50 beschreibt die Induzierung vom programmiertenZelltod durch die erfindungsgemäßen peptidomimetischenMakrocyclen bei einer gemischten Linie von T/B-Zellen einer Leukämiezelllinie(RS4; 11), Behandlung ohne Vorliegen von Serum.
51 beschreibt die Induzierung vom programmiertenZelltod durch die erfindungsgemäßen peptidomimetischenMakrocyclen bei einer Zelllinie eines Burkitt-Lymphoms (Raji), Behandlungohne Vorliegen von Serum.
52 beschreibt die Induzierung vom programmiertenZelltod durch die erfindungsgemäßen peptidomimetischenMakrocyclen bei einer Zelllinie eines Multiplen Myeloms (MM1S),Behandlung ohne Vorliegen von Serum.
53 demonstriert die Wirksamkeit eines erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclus in einem orthotopischen Xenotransplantationsmodellbei SEMK2-Leukämie, Messung basierend auf der reduziertenTumorlast bei den behandelten Tieren.
54 demonstriert die Wirksamkeit eines erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclus in einem orthotopischen Xenotransplantationsmodellbei SEMK2-Leukämie, Messung basierend auf der reduziertenTumorlast bei den behandelten Tieren.
55 demonstriert die Wirksamkeit eines erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclus in einem orthotopischen Xenotransplantationsmodellbei SEMK2-Leukämie, Messung basierend auf der vermehrten Überlebensratebei den behandelten Tieren.
56 zeigt die sequenz- und strukturspezifischeBindung der erfindungsgemäßen peptidomimetischenMakrocyclen an das pro-apoptotische Zielprotein BAX in Zelllysateneines Multiplen Myeloms (MM1S), Darstellung durch Immunpräzipitationanhand des „gestapelten” SP-4-Peptids.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNGSowie im vorliegenden Kontext verwendet, beziehen sich die Begriffe „Behandlung” und „behandeln” aufdie Linderung von Symptomen, die Eliminierung der kausalen Verbindung,und zwar sowohl zeitweise als auch dauerhaft, oder die Vorbeugungoder Verlangsamung des Auftretens von Symptomen. Der Begriff „Behandlung” umfasstdie Linderung, die Eliminierung der kausalen Verbindung (zeitweiseoder dauerhaft) von Symptomen oder die Vorbeugung gegen Symptomeund Gesundheitsstörungen im Zusammenhang mit einem beliebigenZustand. Bei der Behandlung kann es sich um eine Vorbehandlung oderum eine Behandlung nach dem Symptomeintritt handeln.
DerBegriff „standardgemäße Versorgungsmethode” beziehtsich auf ein beliebiges therapeutisches oder diagnostisches Verfahren,eine chemische Verbindung oder Praxis, die Bestandteil der standardgemäßen Patientenversorgungbei einer bestimmten Indikation sind. Der „Behandlungsstandard” kanndurch eine beliebige einschlägige Autorität aufgestelltwerden, wie einem Gesundheitsversorger oder einem nationalen oder regionalenInstitut für Diagnosen oder Behandlungsprozesse, welchevon dem klinischen Personal bei einer gewissen Art von Patient,Krankheit oder klinischem Kontext zu implementieren ist. So werdenbeispielhafte Behandlungsstandarde für verschiedene Krebsartenvom National Cancer Institute (nationales Krebsforschungsinstitut)bereitgestellt.
Sowie im vorliegenden Kontext verwendet, umfasst der Begriff „zellproliferativeStörung” Krebs, hyperproliferative Störungen,neoplastische Krankheiten, immunproliferative Krankheiten und andereGesundheitsstörungen. Eine „zellproliferativeStörung” bezieht sich auf Zellen, die die Kapazitätautonomen Wachstums haben, was soviel bedeutet wie ein abnormalerZustand oder abnormales Befinden, das durch rasch sich vermehrendesZellwachstum gekennzeichnet ist. Hyperproliferative und neoplastischeKrankheitszustände können als pathologisch klassifiziertwerden, was soviel bedeutet wie einen Krankheitszustand charakterisierenoder darstellen. Sie können auch als nicht pathologischklassifiziert werden, was soviel bedeutet wie, dass zwar eine Abweichungvom Normalzustand vorliegt, der aber nicht mit einem Krankheitszustandin Zusammenhang steht. Der Begriff soll alle Arten krebsartigerGewächse oder onkogener Prozesse, metastatischer Gewebeoder maligner transformierter Zellens, Gewebe oder Organe umfassen,unbeschadet des etwaigen histopathologischen Typs oder Stadiumsder Eindringungsfähigkeit. Ein metastatischer Tumor kannaufgrund einer Vielzahl primärer Tumorarten entstehen,einschließlich, und ohne jedoch darauf beschränktzu sein, solcher Tumore mit Ursprung in der Brust, Lunge, Leber,dem Darm und Eierstock „Pathologische hyperproliferative” Zellentreten im Rahmen von Krankheitszuständen auf, die durchmalignes Tumorwachstum und immunoproliferative Krankheiten gekennzeichnetsind. Beispiele nicht pathologischer hyperproliferativer Zellensind unter anderem die Zellproliferationen, die bei der Wundheilungauftreten. Zu den Beispielen proliferativer bzw. differenziativerKrankheiten auf Zellebene gehören Krebserkrankungen wiebeispielsweise Karzinom, Sarkom oder metastatische Krankheiten.
DerBegriff „abgeleitet von” im Zusammenhang der Beziehungzwischen einer Zelllinie und einem verwandten Krebs bedeutet, dassdie Zelllinie aufgrund einer beliebigen Krebserkrankung innerhalbeiner breiten Krebserkrankungskategorie festgestellt werden kann.
Sowie im vorliegenden Kontext verwendet, bezieht sich der Begriff „Makrocyclus” aufein Molekül, das eine chemische Struktur von unter anderemeiner Ring- oder Cyclusstruktur aufweist, wobei der Ring oder Cyclusaus mindestens 9 kovalent gebundenen Atomen gebildet wird.
Sowie im vorliegenden Kontext verwendet, beziehen sich die Begriffe „peptidomimetischerMakrocyclus”, „quervernetztes Polypeptid” oder „gestapeltesPeptid” auf eine Verbindung, die aus einer Mehrzahl von Aminosäurerestenbesteht, die durch eine Mehrzahl von Peptidbindungen miteinanderverbunden werden, und aus mindestens einem macrocyclusbildendenVernetzter, der einen Makrocyclus zwischen einem ersten natürlichauftretenden oder nicht natürlich auftretenden Aminosäurerest(oder Analog) und einem zweiten natürlich auftretendenoder nicht natürlich auftretenden Aminosäurerest(oder Analog) innerhalb desselben Moleküls herstellt. PeptidomimetischeMakrocyclen umfassen Ausführungsformen, in denen der denMakrocyclus bildende Vernetzer den α-Kohlenstoff des erstenAminosäurerests (oder Analogs) mit dem α-Kohlenstoffdes zweiten Aminosäurerests (oder Analogs) verbindet. Diepeptidomimetischen Makrocyclen umfassen wahlweise einen oder mehrerenicht-Peptidbindungen zwischen einem oder mehreren Aminosäurerestenund/oder Aminosäureanalogresten; weiter umfassen sie wahlweiseeinen oder mehrere nicht natürlich vorkommende Aminosäureresteoder Aminosäureanalogreste zusätzlich zu jenen,die den Makrocyclus bilden.
Sowie im vorliegenden Kontext verwendet, bezieht sich der Begriff „Stabilität” aufdie Aufrechterhaltung einer definierten Sekundärstrukturvon einem erfindungsgemäßen peptidomimetischenMakrocyclus in Lösung, wie jeweils mittels Circulardichroismus,NMR oder einer anderen biophysikalischen Messmethode gemessen oderResistenz hinsichtlich proteolytischer Zersetzung in vitro oderin vivo. Beispiele sekundärer Strukturen, die erfindungsgemäß vorgeschlagenwerden und in keinster Weise einen eingrenzenden Charakter haben,sind α-Helixe, β-Drehungen und β-strukturgefalteteBlätter.
Sowie im vorliegenden Kontext verwendet, bezieht sich der Begriff „Helixstabilität” aufdie Aufrechterhaltung der α-Helixstruktur von einem erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclus, wie mittels Circulardichroismusoder NMR gemessen. Beispielsweise zeigen die erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen in manchen Ausführungsformenmindestens eine 1,25-, 1,5-, 1,75- oder 2-fache Zunahme der α-Helizität,jeweils gemäß Bestimmung des Circulardichroismus,im Vergleich zu einem entsprechenden Polypeptid ohne Quervernetzung.
DerBegriff „α-Aminosäure” odereinfach „Aminosäure” bezieht sich aufein Molekül, das sowohl eine Aminogruppe als auch eineCarboxylgruppe aufweist und an einen Kohlenstoff, der als α-Kohlenstoffbezeichnet wird, gebunden ist. Zu den geeigneten Aminosärengehören, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein,die D- und L-Isomeren der natürlich vorkommenden Aminosäurensowie nicht natürlich vorkommende Aminosäuren,die mittels organischer Synthese oder auf anderen metabolischenWegen hergestellt werden. Es sei denn, es werden spezifische anderweitigeAngaben gemacht, bezieht sich der Begriff Aminosäure, sowie er hier verwendet wird, auch auf Aminosäureanaloga.
DerBegriff „natürlich vorkommende Aminosäure” beziehtsich auf eine beliebige der 20 Aminosäuren, die man üblicherweisein natürlich synthetisierten Peptiden antrifft und dieunter den Schriftzeichenabkürzungen A, R, N, C, D, Q, E,G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y und V bekannt sind.
DerBegriff „Aminosäureanalog” oder „nichtnatürliche Aminosäure” bezieht sich aufein Molekül, das mit einer Aminosäure strukturverwandtist und bei der Bildung eines peptidomimetischen Makrocyclus anstelle einerAminosäure substituiert werden kann. Zu den Aminosäureanalogengehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein,Verbindungen, die mit einer Aminosäure strukturidentischsind, insbesondere gemäß der hier dargelegtenDefinition, mit Ausnahme davon, dass eine oder mehrere zusätzlicheMethylengruppen zwischen den Amino- und Carboxylgruppen eingefügtsind (beispielsweise α-Amino-β-Carbonsäuren)oder dass die Amino- oder Carboxylgruppe durch eine ähnlichreaktionsfähige Gruppe substituiert ist (beispielsweiseSubstitution des primären Amins mit einem sekundärenoder tertiären Amin oder Substitution der Carboxylgruppemit einem Ester).
DerBegriff „nicht essenzieller” Aminosäurerestbezieht sich auf einen Rest, dessen platzhalterartige Polypeptidsequenz(beispielsweise eine BH3-Domäne oder die p53 MDM2-Bindungsdomäne)verändert werden kann, ohne dass wesentliche biologischeoder biochemische Aktivitäten beseitigt oder wesentlichverändert werden (beispielsweise Rezeptorbindung oder Aktivierung).Ein „essenzieller” Aminosäurerest istein solcher Rest, der, sofern er von seiner platzhalterartigen Polypeptidsequenzverändert wird, dafür sorgt, dass die essenziellenbiologischen oder biochemischen Aktivitäten des betroffenenPolypeptids beseitigt oder wesentlich verändert werden.
DerBegriff „konservative Aminosäuresubstitution” beziehtsich auf eine Subsitution des Aminosäurerests mit einerAminosäure, die eine ähnliche Seitenkette aufweist.Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenkettensind definitionsgemäß vom Stand der Technik herbekannt. Zu diesen Familien gehören Aminosäuenmit basischen Seitenketten (beispielsweise K, R, H), sauren Seitenketten(beispielsweise D, E), ungeladenen polaren Seitenketten (beispielsweiseG, N, Q, S, T, Y, C), nicht-polaren Seitenketten (beispielsweiseA, V, L, I, P, F, M, W), beta-verzweigten Seitenketten (beispielsweiseT, V, I) und aromatischen Seitenketten (beispielsweise Y, F, W,H). Damit wird ein prädiziert nicht essenzieller Aminosäurerestin einem BH3-Polypeptid bespielsweise bevorzugt mit einem anderenAminosäurerest derselben Seitenkettenfamilie ausgetauscht.Andere Beispiele akzeptabler Substitutionen sind solche, die aufisosterischen Überlegungen (beispielsweise Norleucin fürMethionin) oder auf anderen Eigenschaften (beispielsweise 2-Thienylalaninfür Phenylalanin) beruhen.
DerBegriff „Glied” so wie er im Zusammenhang mitMakrocyclen oder makrocyclusbildenden Vernetzern verwendet wird,bezieht sich auf Atome, die den Makrocyclus bilden oder bilden können;ausgenommen sind substituierende oder Seitenkettenatome. Aufgrundeiner analogen Überlegung gelten Cyclodecan, 1,2-Difluordecanand 1,3-Dimethylcyclodecan als 10-gliedrige Macrocyclen, denn Wasserstoff-oder Fluorsubstituenten oder Methylseitenketten sind nicht an derMakrocyclusbildung beteiligt.
DasSymbolsofernes als Teil einer Molkularstruktur verwendet wird, bezieht sichauf eine Einzelbindung oder eine trans- oder cis-Doppelbindung.
DerBegriff „Aminosäureseitenkette” beziehtsich auf eine funktionelle Gruppe, die an den α-Kohlenstoffin einer Aminosäure angehängt wird. Beispielsweiseist Methyl die Aminosäureseitenkette für Alanin,die Aminosäureseitenkette für Phenylalanin istPhenylmethyl, die Aminosäureseitenkette für Cysteinist Thiomethyl, die Aminosäureseitenkette fürAspartat ist Carboxymethyl, die Aminosäureseitenkette fürTyrosin ist 4-Hydroxyphenylmethyl usw. Andere nicht natürlichvorkommende Aminosäureseitenketten sind auch inbegriffen, wiebeispielsweise solche, die in der Natur vorkommen (beispielsweiseein Aminosäuremetabolit) oder solche, die synthetisch hergestelltwerden (beispielsweise eine α,α di-substituierteAminosäure).
DerBegriff „α,α di-substituierte Aminosäure” beziehtsich auf ein Molekül oder eine funktionelle Gruppe, sowohleine Aminogruppe als auch eine Carboxylgruppe enthaltend und aneinen Kohlenstoff (den α-Kohlenstoff) gebunden, der anzwei natürliche oder nicht natürliche Aminosäureseitenkettenangehängt sind.
DerBegriff „Polypeptid” umfasst zwei oder mehr natürlichoder nicht natürlich vorkommende Aminosäuren,die durch eine kovalente Bindung verbunden sind (beispielsweiseeine Amidbindung). Polypeptide, die hier beschrieben werden, umfassenProteine voller Länge (beispielsweise vollständigverarbeitete Proteine) sowie kürzere Aminosäuresequenzen(beispielsweise Fragmente natürlich vorkommender Proteineoder synthetische Polypeptidfragmente).
DerBegriff „Makrocyclisierungsreagenz” oder „makrocyclusbildendesReagenz”, so wie hier verwendet wird, bezieht sich aufjedes beliebige Reagenz, das für die Zubereitung eineserfindungsgemäßen peptidomimetischen Makrocyclusverwendet werden kann, indem die Reaktion zwischen zwei reaktivenGruppen vermittelt wird. Reaktive Gruppen können beispielsweiseAzid und Alkin sein, in welchem Fall die MacrocyclisierungsreagenzienCu-Reagenzien umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zusein, wie Reagenzien, die reaktive Cu(I)-Spezien bereitstellen,wie CuBr, CuI oder CuOTf und Cu(II)-Salze wie etwa Cu(CO2CH3)2, CuSO4, und CuCl2, diein situ in ein aktives Cu(I)-Reagenz konvertiert werden können,indem sie mit einem Reduktionsmittel wie etwa Ascorbinsäureoder Natriumascorbat versetzt werden. Als Macrocyclisierungsreagenzienkönnen weiter beispielsweise an sich vom Stand der Technikher bekannte Ru-Reagenzien wie Cp·RuCl(PPh3)2, [Cp·RuCl]4 oderandere Ru-Reagenzien verwendet werden, die möglicherweiseeine reaktive Ru(II)-Spezies bereitstellen. In anderen Fällensind die reaktiven Gruppen terminale Olefine. In solchen Ausführungsformensind die Makrocyclisierungsreagenzien oder die makrocyclusbildendenReagenzien Metathesekatalysatoren einschließlich, jedochohne darauf beschränkt zu sein, stabilisierte, späte Übergangsmetallcarbenkomplexkatalysatoren,wie Übergangsmetallcarbenkatalysatoren der Gruppe VIII.Solche Katalysatoren sind beispielsweise Ru und Os Metallzentrenmit einem Oxidationszustand 2+, einer Elektronenzahl von 16, pentakoordiniert.Weitere Katalysatoren werden in Grubbs et al., „RingClosing Metathesis and Related Processes in Organic Synthesis” [RingschließendeMetathese und verwandte organische Syntheseverfahren] Acc. Chem.Res. 1995, 28, 446–452 sowie in US-Patent Nr. 5,811,515 offengelegt.In weiteren Fällen handelt es sich bei den reaktiven Gruppenum Thiolgruppen. In solchen Ausführungsformen ist das Makrocyclisierungsreagenzbeispielsweise ein Vernetzer, der mit zwei thiolreaktiven Gruppenfunktionalisiert wird, wie beispielsweise Halogengruppen.
DerBegriff „Halo” oder „Halogen” beziehtsich auf Fluor, Chlor, Brom oder Iod oder auf ein Radikal hiervon.
DerBegriff „Alkyl” bezieht sich auf eine Kohlenwasserstoffkette,bei der es sich um eine gerade oder verzweigte Kette handelt unddie die jeweils angezeigte Anzahl von Kohlenstoffatomen enthält.Beispielsweise zeigt C1-C10 an,dass die Gruppe 1 bis 10 (einschließlich) Kohlenstoffatomeaufweist. Wenn die numerische Bezeichnung fehlt, stellt „Alkyl” eineKette (gerade oder verzweigt) dar, die 1 bis 20 (einschließlich)Kohlenstoffatome aufweist.
DerBegriff „Alkylen” bezieht sich auf ein divalentesAlkyl (beispielsweise -R-).
DerBegriff „Alkenyl” bezieht sich auf eine Kohlenwasserstoffkette,die gerade oder verzweigt ist und zwei oder mehr Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungenaufweist. Die funktionelle Alkenylgruppe enthält die jeweilsangezeigte Anzahl von Kohlenstoffatomen. Beispielsweise zeigt C2-C10 an, dass dieGruppe zwischen 2 und 10 (einschließlich) Kohlenstoffatomenaufweist. Der Begriff „Niederalkenyl” beziehtsich auf eine C2-C6-Alkenylkette.Wenn die numerische Bezeichnung fehlt, ist „Alkenyl” eineKette (gerade oder verzweigt), die 2 bis 20 (einschließlich)Kohlenstoffatome aufweist.
DerBegriff „Alkinyl” bezieht sich auf eine Kohlenwasserstoffkette,die gerade oder verzweigt ist und eine oder mehr Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindurgenaufweist. Die funktionelle Alkinylgruppe enthält die angezeigteAnzahl von Kohlenstoffatomen. Beispielsweise zeigt C2-C10 an, dass die Guppe 2 bis 10 (einschließlich)Kohlenstoffatome aufweist. Der Begriff „Niederalkinyl” beziehtsich auf eine C2-C6-Alkinylkette. Wenndie numerische Bezeichnung fehlt, ist „Alkinyl” eineKette (gerade oder verzweigt, die 2 bis 20 (einschließlich)Kohlenstoffatome aufweist.
DerBegriff „Aryl” bezieht sich auf ein monocyclischesRingsystem mit 6 Kohlenstoffatomen oder ein bicyclisches aromatischesRingsystem mit 10 Kohlenstoffatomen, wobei 0, 1, 2, 3, oder 4 Atomeeines jeden Rings mit einem Substituenten substituiert sind. Beispielevon Arylgruppen sind Phenyl, Naphthyl usw. Der Begriff „Arylalkyl” oderder Begriff „Aralkyl” bezieht sich auf ein mitAryl substituiertes Alkyl. Der Begriff „Arylalkoxy” beziehtsich auf ein arylsubstituiertes Alkoxy.
DerBegriff „Arylalkyl” bezieht sich auf eine Arylgruppe,wie weiter oben definiert, wobei eines der Wasserstoffatome derArylgruppe mit einer C1-C5-Alkylgruppe,wie weiter oben definiert, ausgetauscht wurde. Zu den repräsentativenBeispielen einer Arylalkylgruppe gehören, ohne jedoch daraufbeschränkt zu sein, 2-Methylphenyl, 3-Methylphenyl, 4-Methylphenyl,2-Etylphenyl, 3-Etylphenyl, 4-Etylphenyl, 2-Propylphenyl, 3-Propylphenyl,4-Propylphenyl, 2-Butylphenyl, 3-Butylphenyl, 4-Butylphenyl, 2-Pentylphenyl,3-Pentylphenyl, 4-Pentylphenyl, 2-Isopropylphenyl, 3-Isopropylphenyl,4-Isopropylphenyl, 2-Isobutylphenyl, 3-Isobutylphenyl, 4-Isobutylphenyl,2-sec-Butylphenyl, 3-sec-Butylphenyl, 4-sec-Butylphenyl, 2-t-Butylphenyl,3-t-Butylphenyl und 4-t-Butylphenyl.
DerBegriff „Arylamido” bezieht sich auf eine Arylgruppe,wie weiter oben definiert, wobei eines der Wasserstoffatome derArylgruppe mit einer oder mehr -C(O)NH2-Gruppenausgetauscht wurde. Zu den repräsentativen Beispielen einerArylamidogruppe gehören 2-C(O)NH2-Phenyl,3-C(O)NH2-Phenyl, 4-C(O)NH2-Phenyl,2-C(O)NH2-Pyridyl, 3-C(O)NH2-Pyridylund 4-C(O)NH2-Pyridyl.
DerBegriff „Alkylheterocyclus” bezieht sich auf eineC1-C5-Alkylgruppe,wie weiter oben definiert, wobei eines der Wasserstoffatome derC1-C5-Alkylgruppemit einem Heterocyclus ersetzt wurde. Zu den repräsentativenBeispielen einer Alkylheterocyclusgruppe gehören, ohnejedoch darauf beschränkt zu sein, -CH2CH2-Morpholin, -CH2CH2-Piperidin, -CH2CH2CH2-Morpholin und-CH2CH2CH2-Imidazol.
DerBegriff „Alkylamido” bezieht sich auf eine C1-C5-Alkylgruppe,wie weiter oben definiert, wobei eines der Wasserstoffatome derC1-C5-Alkylgruppemit einer -C(O)NH2-Gruppe ersetzt wurde.Zu den repräsentativen Beispielen einer Alkylamidogruppegehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein,-CH2-C(O)NH2, -CH2CH2-C(O)NH2, -CH2CH2CH2C(O)NH2, -CH2CH2CH2CH2C(O)NH2, -CH2CH2CH2CH2CH2C(O)NH2, -CH2CH(C(O)NH2)CH3, -CH2CH(C(O)NH2)CH2CH3,-CH(C(O)NH2)CH2CH3, -C(CH3)2CH2C(O)NH2, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH3, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH3-CH3 und -CH2-CH2-NH-C(O)-CH=CH2.
DerBegriff „Alkanol” bezieht sich auf eine C1-C5-Alkylgruppe,wie weiter oben definiert, wobei eines der Wasserstoffatome derC1-C5-Alkylgruppemit einer Hydroxylgruppe ersetzt wurde. Zu den repräsentativen Beispieleneiner Alkanolgruppe gehören, ohne jedoch darauf beschränktzu sein, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2CH2CH2OH, -CH2CH2CH2CH2OH, -CH2CH2CH2CH2CH2OH, -CH2CH(OH)CH3, -CH2CH(OH)CH2CH3, -CH(OH)CH3 und -C(CH3)2CH2OH.
DerBegriff „Alkylcarboxy” bezieht sich auf eine C1-C5-Alkylgruppe,wie weiter oben definiert, wobei eines der Wasserstoffatome derC1-C5-Alkylgruppemit einer -COOH-Gruppe ersetzt wurde. Zu den repräsentativenBeispielen einer Alkylcarboxygruppe gehören, ohne jedochdarauf beschränkt zu sein, -CH2COOH, -CH2CH2COOH, -CH2CH2CH2COOH,-CH2CH2CH2CH2COOH, -CH2CH(COOH)CH3, -CH2CH2CH2CH2CH2COOH, -CH2CH(COOH)CH2CH3, -CH(COOH)CH2CH3 and -C(CH3)2CH2COOH.
DerBegriff „Cycloalkyl”, so wie er hier verwendetwird, umfasst gesättigte und teilweise ungesättigte cyclischeKohlenwasserstoffgruppen, die 3 bis 12 Kohlenstoffatome aufweisen,bevorzugt 3 bis 8 Kohlenstoffatome und am meisten bevorzugt 3 to6 Kohlenstoffatome, wobei die Cycloalkylgruppe zusätzlichwahlweise substitutiert ist. Einige Cycloalkylgruppen sind unteranderem, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Cyclopropyl,Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclopentenyl, Cyclohexyl, Cyclohexenyl,Cycloheptyl und Cyclooctyl.
DerBegriff „Heteroaryl” bezieht sich auf ein aromatisches5–8-gliedriges monocyclisches, 8–12-gliedrigesbicyclisches oder 11–14-gliedriges tricyclisches Ringsystem,das 1–3 Heteroatome aufweist, wenn es monocyclisch, 1–6Heteroatome, wenn es bicyclisch oder 1–9 Heteroatome, wennes tricyclisch ist, wobei die besagten Heteroatome unter O, N oderS (beispielsweise Kohlenstoffatome und 1–3, 1–6oder 1–9 Heteroatome von O, N oder S, wenn jeweils monocyclisch,bicyclisch oder tricyclisch) ausgewählt werden, wobei 0,1, 2, 3 oder 4 Atome jedes Rings mit einem Substituenten substituiertsind. Beispiele für Heteroarylgruppen sind unter anderemPyridyl, Furyl oder Furanyl, Imidazolyl, Benzimidazolyl, Pyrimidinyl,Thiophenyl oder Thienyl, Chinolinyl, Indolyl, Thiazolyl usw.
DerBegriff „Heteroarylalkyl” oder der Begriff „Heteroaralkyl” beziehtsich auf ein mit einem Heteroaryl substituierten Alkyl. Der Begriff „Heteroarylalkoxy” beziehtsich auf ein mit einem Heteroaryl substituierten Alkoxy. Der Begriff „Heteroarylalkyl” oderder Begriff „Heteroaralkyl” bezieht sich auf mitHeteroaryl substituiertes Alkyl. Der Begriff „Heteroarylalkoxy” beziehtsich auf mit Heteroaryl substituiertes Alkoxy. Der Begriff „Heterocyclyl” beziehtsich auf ein nicht aromatisches 5–8-gliedriges monocyclisches,8–12-gliedriges bicyclisches oder 11–14-gliedrigestricyclisches Ringsystem, das 1–3 Heteroatome aufweist,wenn es monocyclisch, 1–6 Heteroatome, wenn es bicyclischoder 1–9 Heteroatome, wenn es tricyclisch ist, wobei diebesagten Heteroatome unter O, N oder S (beispielsweise Kohlenstoffatomeund 1–3, 1–6 oder 1–9 Heteroatome vonO, N oder S jeweils, wenn monocyclisch, bicyclisch oder tricyclisch)ausgewählt werden, wobei 0, 1, 2 oder 3 Atome jedes Ringsmit einem Substituenten substituiert sind. Beispiele für Heterocyclylgruppensind unter anderem Piperazinyl, Pyrrolidinyl, Dioxanyl, Morpholinyl,Tetrahydrofuranyl usw.
DerBegriff „Substituent” bezieht sich auf eine Gruppe,die ein zweites Atom oder eine Gruppe ersetzt, wie etwa ein Wasserstoffatoman einem beliebigen Molekül, einer beliebigen Verbindungoder einer beliebigen funktionellen Gruppe. Geeignete Substituentensind unter anderem, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein, Halo-,Hydroxy-, Mercapto-, Oxo-, Nitro-, Haloalkyl-, Alkyl-, Alkaryl-,Aryl-, Aralkyl-, Alkoxy-, Thioalkoxy-, Aryloxy-, Amino-, Alkoxycarbonyl-,Amido-, Carboxy-, Alkanesulfonyl-, Alkylcarbonyl- und Cyanogruppen.
Inmanchen Ausführungsformen enthalten die erfindungsgemäßenVerbindungen ein oder mehr asymmetrische Zentren und treten somitals Razemate und razemische Mischungen, einzelne Enantiomere, individuelleDiastereomere und diastereomerische Gemische auf. Sämtlichederartigen isomere Formen dieser Verbindungen fallen in den Geltungsbereichdieser Erfindung, es sei denn, es werden ausdrücklich andereAngaben gemacht. In manchen Ausführungsformen sind dieerfindungsgemäßen Verbindungen auch in mehreren tautomerenFormen dargestellt; in solchen Fällen bezieht sich dieErfindung auf alle tautomeren Formen der hier beschriebenen Verbindungen(beispielsweise wenn die Alkylierung eines Ringsystems dazu führt,dass eine Alkylierung an mehreren Stellen auftritt, so fallen alleReaktionsprodukte in den Geltungsbereich der Erfindung). Alle solcheisomeren Formen solcher Verbindungen fallen in den Geltungsbereichdieser Erfindung, es sei denn, es werden ausdrücklich andereAngaben gemacht. Alle Kristallformen der hier beschriebenen Verbindungenfallen in den Geltungsbereich dieser Erfindung, es sei denn, eswerden ausdrücklich andere Angaben gemacht.
DieBegriffe „Zunahme” und „Abnahme”,so wie sie hier verwendet werden, bedeuten jeweils das Verursacheneiner statistisch signifikanten (beispielsweise p 0,1) Zunahme oderAbnahme von mindestens 5%.
Sowie hier verwendet, soll die Rezitation eines numerischen Bereichseiner Variable vermitteln, dass die Erfindung mit einer Variable,die innerhalb eines solchen Bereiches fällt, praktiziertwerden kann. Daher ist eine Variable, die an sich diskret ist, gleicheinem beliebigen Ganzzahlwert innerhalb des numerischen Bereichs,einschließlich der Endpunkte des Bereichs. Ähnlichgilt für eine Variable, die an sich kontinuierlich ist, dassdie Variable gleich einem beliebigen realen Wert innerhalb des numerischenBereichs, einschließlich der Endpunkte des Bereichs, ist.Als Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, gilt,dass eine Variable, die als Wert zwischen 0 und 2 beschrieben wird,die Werte 0, 1 oder 2 annimmt, wenn die Variable an sich diskret ist;sie nimmt die Werte 0,0, 0,1, 0,01, 0,001 oder einen beliebigenanderen realen Wert ≥ 0 und ≤ 2 an, wenn die Variablean sich kontinuierlich ist.
DerBegriff „oder”, so wie er hier verwendet wirdund sofern keine spezifischen anderweitigen Angaben gemacht werden,wird im einschließenden Sinne von „und/oder” undnicht im ausschließenden Sinn von „entweder/oder” verwendet.
DerBegriff „im Durchschnitt” bezieht sich auf denmittleren Wert, der von der mindestens dreifachen unabhängigenReplikationen für jeden Datenpunkt abgeleitet wird.
DerBegriff „biologische Aktivität” umfasstdie strukturellen und funktionellen Eigenschaften eines erfindungsgemäßenMakrocyclus. Die biologische Aktivität ist beispielsweisedie strukturelle Stabilität, alpha-Helizität,zielgerichtete Affinität, Beständigkeit gegenproteolytische Zersetzung, Zelleindringungsfähigkeit, intrazelluläreStabilität, in vivo Stabilität oder eine beliebigeKombination hiervon.
DieEinzelheiten eines oder mehrerer Ausführungsformen sindin den Begleitzeichnungen und der nachstehenden Beschreibung dargelegt.Andere Merkmale, Gegenstände und Vorteile der Erfindungergeben sich aus der Beschreibung und den Zeichnungen sowie auchaus den Ansprüchen.
Design der erfindungsgemäßenpeptidomimetischen MakrocyclenGegenstandder Erfindung sind Proteine oder Polypeptide mit einer bekanntenprimären Aminosäuresequenz, die eine helikaleStruktur aufweisen und von angenommen wird, dass sie biologischeAktivität ausüben. Beispielsweise kann die Sequenzdes Polypeptids analysiert werden, und es können Aminosäureanaloga,die Gruppen enthalten, die mit Makrocyclisierungsreagenzien reaktionsfähigsind, an den entsprechenden Positionen subsitutiert werden. Dieentsprechenden Positionen werden bestimmt, indem festgestellt wird,welche molekulare(n) Oberfläche(n) der Sekundärstrukturfür die biologische Aktivität erforderlich ist(sind); und damit wird festgestellt, über welche andere(n)Oberfläche(n) hinweg die erfindungsgemäßenVernetzer einen Makrocylcus bilden können, ohne die Oberfläche(n),die für die biologische Aktivität benötigtwird (werden), sterisch zu blockieren. Solche Bestimmungen erfolgenunter Verwendung von Verfahren wie Röntgenkristallographieder Komplexe zwischen der Sekundärstruktur und einem natürlichenBindungspartner, um die Reste (und Oberflächen), die fürdie Aktivität kritisch sind, zu visualisieren. Weiter wirddie sequenzielle Mutagenese der Reste innerhalb der Sekundärstrukturverwendet, um Reste (und Oberflächen), die fürdie Aktivität kritisch sind, funktionell zu identifizieren;oder es werden weitere Methoden eingesetzt. Basierend auf solchenBestimmungen werden die entsprechenden Aminosäuren mitAminosäureanaloga und erfindungsgemäßenVernetzern, die den Makrocyclus bilden, substituiert. Beispielsweisekann es sein, dass es bei einer α-helixförmigen Sekundärstrukturnotwendig ist, dass eine Oberfläche der Helix (beispielsweiseeine molekulare Oberfläche, die sich längsweiseentlang der Achse der Helix und radial 45–135° umdie Achse der Helix erstreckt) unter Umständen einen Kontaktmit einem anderen Biomolekül in vivo oder in vitro herstellenmuss, damit eine biologische Aktivität erfolgt. In einemsolchen Fall sieht das Design eines makrocyclusbildenden Vernetzersvor, dass der Vernetzer zwei α-Kohlenstoffe der Helix vernetzt,während er sich in dem Teil längsweise entlangder Oberfläche erstreckt, der nicht direkt fürdie Aktivität erforderlich ist.
Inmanchen erfindungsgemäßen Ausführungsformenwird die Peptidsequenz von Proteinen der BCL-2-Familie abgeleitet.Die BCL-2-Familie definiert sich durch das Vorliegen von bis zuvier konservierten BCL-2-Homologiedomänen (BH), die mitBH1, BH2, BH3 und BH4 bezeichnet werden und die alle α-helixförmigeSegmente enthalten (Chittenden et al. (1995), EMBO 14: 5589; Wanget al. (1996), Genes Dev. 10: 2859). Anti-apoptotischeProteine wie BCL-2 und BCL-XL zeigen Sequenzkonservierungin allen BH-Domänen. Pro-apoptotische Proteine werden in „Multidomänen-”Familienmitglieder(beispielsweise BAK, BAX) mit Homologie in den BH1-, BH2- und BH3-Domänenund „nur-BH3-Domäne”-Familienmitglieder(beispielsweise BID, BAD, BIM, BIK, NOXA, PUMA), die ausschließlichim BH3-amphipathischen, α-helikalen Segment Sequenzhomologiehaben, unterteilt. BCL-2-Familienmitglieder haben die Fähigkeit,Homo- und Heterodimere zu bilden, wodurch nahegelegt wird, dassdie kompetitive Bindungsaktivität und das Verhältnisvon pro- und anti-apoptotischen Proteinpegel die Anfälligkeitfür den Todesstimulus diktiert. Die anti-apoptotische Proteinfunktionschützt Zellen gegen pro-apoptotische Überaktivität,beispielsweise exzessiven programmierten Zelltod. Weitere „Sicherheitsmaßnahmen” sindunter anderem die Regulierung der Transkription pro-apoptotischer Proteineund deren Pflege als inaktive Konformere, die entweder einer proteolytischenAktivierung, Dephosphorylation oder ligandeninduzierten Konformationsänderungbedürfen, damit die den Zelltod unterstützenden Funktionenaktiviert werden. Bei gewissen Zelltypen lösen Todessignale,die an der Plasmamembran empfangen werden, die Apoptose überdie mitochondrielle Route aus. Die Mitochondrien könnenals Wächter der Auslösung des Zelltods dienen,indem sie Cytochrom c sequestrieren, ein kritischer Bestandteileines cytosolischen Komplexes, der Caspase 9 aktiviert, wodurchnachgeschaltete tödliche proteolytische Ereignisse ausgelöstwerden. Multidomänen-Proteine wie BCL-2/BCL-XL undBAK/BAX spielen die duellierende Rollen von Fürsorger undHenker an der mitochondriellen Membran, wobei deren Aktivitätendurch vorgeschaltete nur-BH3-Mitglieder der BCL-2-Familie weiterreguliert werden. Beispielsweise ist BID ein Mitglied der nur-BH3-Domänenfamiliepro-apoptotischer Proteine und überträgt Todessignale,die an der Plasmamembran empfangen werden, an die pro-apoptotischenEffektorproteine der mitochondriellen Membran. BID hat die Fähigkeit,sowohl mit pro- als auch anti-apoptotischen Proteinen in eine Wechselwirkungzu treten und löst nach erfolgter Aktivierung von Caspase8 die Freisetzung von Cytochrom c und die mitochondrielle Apoptoseaus. Deletions- und Mutagenesestudien haben ergeben, dass das amphipathische, α-helikaleBH3-Segment pro-apoptotischer Familienmitglieder möglicherweiseals Todesdomäne funktioniert und damit möglicherweise einkritisches Strukturmotiv für die Interaktion mit apoptotischenMultidomänen-Proteinen darstellt. Strukturstudien habengezeigt, dass die BH3-Helix durch Einfügung in eine hydrophobeKerbe, die an der Schnittstelle der BH1-, -2- and -3-Domänengebildet wird, in der Lage ist, mit anti-apoptotischen Proteinenin Wechselwirkung zu treten. Aktiviertes BID kann von anti-apoptotischenProteinen (beispielsweise BCL-2 und BCL-XL)gebunden und isoliert werden und kann die Aktivierung der pro-apoptotischenProteine BAX und BAK auslösen, wodurch die Freisetzungvon Cytochrom c erfolgt und ein mitochondrielles Apoptoseprogrammabläuft. BAD ist zudem ein pro-apoptotisches Familienmitgliedmit nur-BH3-Domäne, dessen Expression die Aktivierung vonBAX/BAK auslöst. Im Kontrast zu BID bindet BAD jedoch bevorzugtan die anti-apoptotischen Familienmitglieder BCL-2 und BCL-XL. Während die BAD-BH3-Domäneeine hohe Bindungsaffinität für BCL-2 zeigt, ist dasBAD-BH3-Peptid nicht in der Lage, die Freisetzung von Cytochromc von Mitochondrien in vitro zu aktivieren, was nahelegt, dass BADkein direkter Aktivator von BAX/BAK ist. Mitochondrien, die BCL-2 überexprimierensind gegen die BID-induzierte Freisetzung von Cytochrom c resistent,aber die Mitbehandlung mit BAD kann die BID-Sensitivitätwiederherstellen. Die Induzierung von mitochondrieller Apoptosedurch BAD scheint aufzutreten zum Einen infolge von: (1) Verlagerungder BAX/BAK-Aktivatoren, wie BID- und BID-ähnlichen Proteinenaus der BCL-2/BCL-XL-Bindungstasche; oder (2) selektive Belegungder BCL-2/BCL-XL-Bindungstasche durch BAD als Vorbeugung gegen dieIsolierung von BID-ähnlichen Proteinen durch anti-apoptotische Proteine.Es gibt daher nunmehr zwei Klassen von nur-BH3-Domänen-Proteinen:BID-ähnliche Proteine, die die mitochondrielle Apoptosedirekt aktivieren, und BAD-ähnlicbe Proteine, die die Fähigkeithaben, Mitochondrien für BID-ähnliche pro-Apoptotikazu sensibilisieren, indem sie die Bindungstasche von multidomänigen anti-apoptotischenProteinen belegen. Verschiedene α-helikale Domänender Mitgliederproteine der BCL-2-Familie, welche auf die hier offengelegteMethodologie ansprechen, wurden an anderer Stelle offengelegt (Walenskyet al. (2004), Science 305: 1466; and Walensky et al., US-PatentveröffentlichungNr. 2005/0250680, wobei die gesamte Offenlegung durch Bezugnahmeim Vorliegenden aufgenommen wird).
Einenicht beschränkende beispielhafte Liste der geeignetenPeptidsequenzen zur Verwendung im Kontext dieser Erfindung: TABELLE1 Tabelle 1 führt die Humansequenzen auf,deren Ziel die BH3-Bindungsstelle ist und die für Krebserkrankungen,Autoimmunkrankheiten, Stoffwechselkrankheiten und andere Kranhkeitszuständeim Menschen verantwortlich gemacht werden. TABELLE2
Tabelle 2 führt die Humansequenzen auf,deren Ziel die BH3-Bindungsstelle ist und die für Krebserkrankungen,Autoimmunkrankheiten, Stoffwechselkrankheiten und andere Kranhkeitszuständeim Menschen verantwortlich gemacht werden.
Inmanchen Ausführungsformen des Verfahrens enthältein erfindungsgemäßes Polypeptid eine Quervernetzung.In anderen Ausführungsformen enthält das besagtePolypeptid zwei Quervernetzungen. In manchen Ausführungsformendes Verfahrens verbindet eine Quervernetzung zwei α-Kohlenstoffatome.In anderen Ausführungsformen des Verfahrens ist ein α-Kohlenstoffatom,an dem eine Quervernetzung angehängt ist, mit einem Substituentender Formel R-substituiert. In einer anderen Ausführungsformdes Verfahrens sind zwei α-Kohlenstoffatome, an denen eineQuervernetzung angehängt ist, mit unabhängigenSubstituenten der Formel R-substituiert. In einer Ausführungsformdes erfindungsgemäßen Verfahrens ist R-Alkyl.Beispielsweise ist R-Methyl. In anderen Fällen könnenR- und ein beliebiger Teil einer Vernetzung zusammengenommen eine cyclischeStruktur bilden. In einer anderen Ausführungsform des Verfahrenswird eine Vernetzung durch konsekutive Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungengebildet. Beispielsweise kann eine Quervernetzung mindestens 8,9, 10, 11 oder 12 konsekutive Bindungen enthalten. In anderen Ausführungsformenkann eine Quervernetzung mindestens 7, 8, 9, 10 oder 11 Kohlenstoffatomeumfassen.
Ineiner anderen Ausführungsform des Verfahrens besteht dasquervernetzte Polypeptid aus einer α-helikalen Domäneeines Mitglieds der BCL-2-Familie. Beispielsweise enthältdas quervernetzte Polypeptid eine BH3-Domäne. In anderenAusführungsformen enthält das quervernetzte Polypeptidmindestens 60%, 70%, 80%, 85%, 90% oder 95% der Sequenzen in Tabellen1, 2, 3 und 4. In manchen Ausführungsformen des Verfahrensdurchdringt das quervernetzte Polypeptid Zellmembranen mittels einesenergieabhängigen Prozesses und legt sich an das intrazelluläreBindungsziel an.
Inmanchen Ausführungsformen enthält das besagtehelixförmige Polypeptid eine Quervernetzung. In anderenAusführungsformen enthält das besagte helixförmigePolypeptid zwei Quervernetzungen.
Inmanchen Ausführungsformen verbindet eine Quervernetzungzwei α-Kohlenstoffatome. In anderen Ausführungsformendes Verfahrens ist ein α-Kohlenstoffatom, an dem eine Quervernetzungangehängt ist, mit einem Substituenten der Formel R-substituiert.In einem anderen Ausführungsform des Verfahrens sind zwei α-Kohlenstoffatome,an denen eine Quervernetzung angehängt ist, mit unabhängigenSubstituenten der Formel R-substituiert. In einer Ausführungsformdes erfindungsgemäßen Verfahrens ist R-Alkyl.Beispielsweise ist R-Methyl. In anderen Fällen könnenR- und ein beliebiger Teil einer Vernetzung zusammengenommen eine cyclischeStruktur bilden. In einem anderen Ausführungsform des Verfahrenswird eine Vernetzung durch konsekutive Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungengebildet. Beispielsweise kann eine Quervernetzung mindestens 8,9, 10, 11 oder 12 konsekutive Bindungen enthalten. In anderen Ausführungsformenkann eine Quervernetzung mindestens 7, 8, 9, 10 oder 11 Kohlenstoffatomeumfassen.
Ineiner anderen Ausführungsform des Verfahrens besteht dasquervernetzte Polypeptid aus einer α-helixförmigenDomäne eines Mitglieds der BCL-2-Familie. Beispielsweiseenthält das quervernetzte Polypeptid eine BH3-Domäne.In anderen Ausführungsformen enthält das quervernetztePolypeptid mindestens 60%, 70%, 80%, 85%, 90% oder 95% der Sequenzenin Tabellen 1, 2, 3 und 4. In manchen Ausführungsformendes Verfahrens durchdringt das quervernetzte Polypeptid Zellmembranenmittels eines energieabhängigen Prozesses und legt sichan das intrazelluläre Bindungsziel an.
Inmanchen Ausführungsformen haben die erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen die Formel (I):
Hierbeiist:
A, C, D bzw. E jeweils unabhängig eine natürlicheoder nicht natürliche Aminosäure;
B ist einenatürliche oder nicht natürliche Aminosäure,Aminosäureanalog,[-NH-L3-CO-],[-NH-L3-SO2-] oder[-NH-L3-],
R1 undR2 sind unabhängig -H, Alkyl, Alkenyl,Alkinyl, Arylalkyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Heteroalkyl oder Heterocycloalkyl,unsubstituiert oder substituiert mit Halo-;
R3 istWasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Arylalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl,Heterocycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Cycloaryl oder Heterocycloaryl,wahlweise mit R5 substituiert;
L istein Vernetzer, der einen Makrocyclus bildet, der Formel -L1-L2-;
L1 und L2 sind unabhängigAlkylen, Alkenylen, Alkinylen, Heteroalkylen, Cycloalkylen, Heterocycloalkylen,Cycloarylen, Heterocycloarylen oder [-R4-K-R4-]n, jeweils wahlweisemit R5 substituiert;
R4 istjeweils Alkylen, Alkenylen, Alkinylen, Heteroalkylen, Cycloalkylen,Heterocycloalkylen, Arylen oder Heteroarylen;
K ist jeweilsO, S, SO, SO2, CO, CO2 oderCONR3;
R5 istjeweils unabhängig Halogen, Alkyl, -OR6,-N(R6)2, -SR6, -SOR6, -SO2R6, -CO2R6, eine fluoreszierende funktionelle Gruppe,ein Radioisotop oder ein therapeutisches Mittel;
R6 istjeweils unabhängig -H, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Arylalkyl,Cycloalkylalkyl, Heterocycloalkyl, eine fluoreszierende funktionelleGruppe, ein Radioisotop oder ein therapeutisches Mittel;
R7 ist -H, Alkyl, Alkenyl, Alkenyl, Arylalkyl,Cycloalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkylalkyl, Heterocycloalkyl, Cycloaryl oderHeterocycloaryl, wahlweise mit R5 substituiertoder Teil einer cyclischen Struktur mit einem D-Rest;
R8 ist -H, Alkyl, Alkenyl, Alkenyl, Arylalkyl,Cycloalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkylalkyl, Heterocycloalkyl, Cycloaryl oderHeterocycloaryl, wahlweise mit R5 substituiertoder Teil einer cyclischen Struktur mit einem E-Rest;
v undw sind jeweils unabhängig eine Ganzzahl zwischen 1 und1000;
x, y und z sind jeweils unabhängig eine Ganzzahlzwischen 0 und 10; u ist eine Ganzzahl zwischen 1 und 10; und
nist eine Ganzzahl zwischen 1 und 5.
Ineinem Beispiel ist mindestens einer von R1 undR2 Alkyl, unsubstituiert oder mit Halo-substituiert.In einem anderen Beispiel sind R1 und R2 unabhängig Alkyl, unsubstituiertoder mir Halo-substituiert. In manchen Ausführungsformenist mindestens eins von R1 und R2 Methyl. In anderen Ausführungsformensind R1 und R2 Methyl.
Inmanchen erfindungsgemäßen Ausführungsformenist x + y + z mindestens 3. In anderen erfindungsgemäßenAusführungsformen ist x + y + z 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9 oder 10. Jedes Auftreten von A, B, C, D oder E in einem Makrocyclusoder einer erfindungsgemäßen Vorstufe eines Makrocycluswird unabhängig ausgewählt. Beispielsweise umfassteine Sequenz, die mit der Formel [A]x dargestelltwird, wenn x = 3, Ausführungsformen, in denen die Aminosäurennicht identisch sind, beispielsweise Gln-Asp-Ala, sowie Ausführungsformen,in denen die Aminosäuren identisch sind, beispielsweiseGln-Gln-Gln. Dies trifft für jeden Wert x, y oder z inden angezeigten Bereichen zu.
Inmanchen Ausführungsformen enthält der erfindungsgemäßepeptidomimetische Makrocyclus eine Sekundärstruktur, dieeine α-Helix ist, und R8 ist -H,wobei Wasserstoffbindungen innerhalb der Helix möglich sind.In manchen Ausführungsformen ist mindestens eins von A,B, C, D oder E eine α,α-di-substituierte Aminosäure.In einem Beispiel ist B eine α,α-di-substituierteAminosäure. Beispielsweise ist mindestens eins von A, B,C, D oder E 2-Aminoisobuttersäure. In anderen Ausführungsformenist mindestens eins von A, B, C, D oder E
Inanderen Ausführungsformen wird die Länge des denMakrocyclus bildenden Vernetzers, jeweils gemessen von einem erstenCα zu einem zweiten Cα, entsprechend gewählt,um eine gewünschte sekundäre Peptidstruktur zustabilisieren, wie eine α-Helix, die aus Resten des peptidomimetischenMakrocyclus gebildet wird, einschließlich, ohne jedochhierauf notwendigerweise beschränkt zu sein, jenen zwischendem ersten Cα bis zum zweiten Cα.
Ineiner Ausführungsform ist der peptidomimetische Makrocyclusder Formel (I):
Undhierin sind R1 und R2 unabhängig-H, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Arylalkyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Heteroalkyloder Heterocycloalkyl, unsubstituiert oder mit Halo-substituiert.
Inverwandten Ausführungsformen ist der peptidomimetischeMakrocyclus der Formel (I): oder
Inanderen Ausführungsformen ist der peptidomimetische Makrocyclusder Formel (I) eine Verbindung einer beliebigen der nachstehendabgebildeten Formeln: und hierinist „AA” eine beliebige natürliche odernicht natürliche Seitenkette einer Aminosäureund
ist[D]v, [E]w wie vorstehenddefiniert, und n ist eine Ganzzahl zwischen 0 und 20, 50, 100, 200,300, 400 oder 500. In manchen Ausführungsformen ist n =0. In anderen Ausführungsformen ist n kleiner 50.
BeispielhafteAusführungsformen für einen den Makrocyclus bildendenVernetzer L sind nachfolgend abgebildet. R = H,Alkyl, anderer Substituent
BeispielhafteAusführungsformen eines erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclus sind nachfolgend abgebildet: AndereAusführungsformen erfindungsgemäßer peptidomimetischerMakrocyclen sind unter anderem die Analoga der vorstehend abgebildetenMakrocyclen.
Inmanchen Ausführungsformen haben die erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen die Formel (II): Und hierin sind:
A,C, D und E jeweils unabhängig eine natürlicheoder nicht natürliche Aminosäure;
B ist einAnalogon einer natürlichen oder nicht natürlichenAminosäure,[-NH-L3-CO-],[-NH-L3-SO2-] oder[-NH-L3-];
R1 undR2 sind unabhängig -H, Alkyl, Alkenyl,Alkinyl, Arylalkyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Heteroalkyl oder Heterocycloalkyl,unsubstituiert oder mit Halo-substituiert;
R3 istWasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Arylalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl,Heterocycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Cycloaryl oder Heterocycloaryl,wahlweise mit R5 substituiert;
L istein Vernetzer, der einen Makrocyclus bildet, der Formel L1,L2 und L3 sind unabhängigAlkylen, Alkenylen, Alkinylen, Heteroalkylen, Cycloalkylen, Heterocycloalkylen, Cycloarylen,Heterocycloarylen oder [-R4-K-R4-]n, jeweils wahlwesie mit R5 substituiert;
R4 ist jeweils Alkylen, Alkenylen, Alkinylen,Heteroalkylen, Cycloalkylen, Heterocycloalkylen, Arylen oder Heteroarylen;
Kist jeweils O, S, SO, SO2, CO, CO2 oder CONR3;
R5 ist jeweils unabhängig Halogen,Alkyl, -OR6, -N(R6)2, -SR6, -SOR6, -SO2R6,-CO2R6, eine fluoreszierende funktionelleGruppe, ein Radioisotop oder ein therapeutisches Mittel;
R6 ist jeweils unabhängig -H, Alkyl,Alkenyl, Alkinyl, Arylalkyl, Cycloalkylalkyl, Heterocycloalkyl,eine fluoreszierende funktionelle Gruppe, ein Radioisotop oder eintherapeutisches Mittel;
R7 ist -H,Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Arylalkyl, Cycloalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkylalkyl,Heterocycloalkyl, Cycloaryl oder Heterocycloaryl, wahlweise mitR5 substituiert oder Teil einer cyclischenStruktur mit einem D-Rest;
R8 ist -H,Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Arylalkyl, Cycloalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkylalkyl,Heterocycloalkyl, Cycloaryl oder Heterocycloaryl, wahlweise mitR5 substituiert oder Teil einer cyclischenStruktur mit einem E-Rest;
v und w sind jeweils unabhängigeine Ganzzahl zwischen 1 und 1000;
x, y und z sind jeweilsunabhängig eine Ganzzahl zwischen 0 und 10; u ist eineGanzzahl zwischen 1 und 10; und
n ist eine Ganzzahl zwischen1 und 5.
Ineinem Beispiel ist mindestens eins von R1 undR2 ein Alkyl, unsubstituiert oder mit Halo-substituiert. In einem anderen Beispiel sind R1 undR2 unabhängig Alkyl, unsubstituiert oder mit Halo-substituiert.In manchen Ausführungsformen ist mindestens eins von R1 und R2 Methyl.In anderen Ausführungsformen sind R1 undR2 Methyl.
Inmanchen erfindungsgemäßen Ausführungsformenist x + y + z mindestens 3. In anderen erfindungsgemäßenAusführungsformen ist x + y + z 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9 oder 10. Jedes Auftreten von A, B, C, D oder E in einem Makrocyclusoder einem Vorläufer eines erfindungsgemäßenMakrocyclus wird unabhängig gewählt. Beispielsweiseumfasst eine Sequenz, die mit der Formel [A]x dargestelltwird, wenn x = 3 ist, Ausführungsformen, in denen die Aminosäurennicht identisch sind, beispielsweise Gln-Asp-Ala, sowie Ausführungsformen,in denen die Aminosäuren identisch sind, beispielsweiseGln-Gln-Gln. Dies trifft auf jeden beliebigen Wert von x, y oderz in den angezeigten Bereichen zu.
Inmanchen Ausführungsformen enthält der erfindungsgemäßepeptidomimetische Makrocyclus eine Sekundärstruktur, dieeine α-Helix ist, und R8 ist -H,wodurch Wasserstoffbindungen innerhalb der Helix ermöglichtwerden. Bei manchen Ausführungsformen ist mindestens einsvon A, B, C, D oder B eine α,α-di-substituierteAminosäure. In einem Beispiel ist B eine α,α-di-substituierteAminosäure. Beispielsweise ist eins von A, B, C, D oderB 2-Aminoisobuttersäure. In anderen Ausführungsformenist mindestens eins von A, B, C, D oder B
Inanderen Ausführungsformen wird die Länge des VernetzersL, der den Makrocyclus bildet, jeweils gemessen von einem erstenCα bis zu einem zweiten Cα, entsprechend gewählt,um eine gewünschte sekundäre Peptitdstruktur zustabilisieren, wie eine α-Helix, die aus Resten des peptidomimetischenMakrocyclus gebildet wird, einschließlich, ohne jedochhierauf notwendigerweise begrenzt zu sein, jenen zwischen dem ersten Cα undzweiten Cα.
Ausführungsformendes Vernetzers L, der den Makrocyclus bildet, sind nachstehend abgebildet.
Inanderen Ausführungsformen stellt die Erfindung peptidomimetischeMacrocyclen mit der Formel (III) bereit: wobei:
A, C, D und Ejeweils unabhängige natürliche oder künstlicheAminosäuren darstellen;
B eine natürlicheoder nicht natürliche Aminosäure, Aminosäureanalogon,[-NH-L4-CO-],[-NH-L4-SO2-], oder[-NH-L4-] darstellt;
R1 undR2 sind unabhängig -H, Alkyl, Alkenyl,Alkinyl, Arylalkyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Heteroalkyl oder Heterocycloalkyl,unsubstituiert oder mit Halogen substituiert;
R3 isWasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Arylalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl,Heterocycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Cycloaryl oder Heterocycloalkyl,unsubstituiert oder mit R5 substituiert;
L1, L2, L3 undL4 sind unabhängig voneinanderAlkylen, Alkenylen, Alkinylen, Heteroalkylen, Ccycloalkylen, Heterocycloalkylen,Cycloarylen, Heterocycloarylene oder [-R4-K-R4-]n, jeweils unsubstituiert oder mit R5 substituiert;
und K ist O, S, SO,SO2, CO, CO2 oderCONR3;
wobei R4 istjeweils Alkylen, Alkenylen, Alkinylen, Heteroalkylen, Cycloalkylen,Heterocycloalkylen, Arylen oder Heteroarylen;
R5 jeweilsunabhängig Wasserstoff, Alkyl, -OR6,-N(R6)2, -SR6, -SOR6, -SO2R6, -CO2R6, einen fluoreszierenden Rest, ein Radioisotopoder oder ein therapeutisches Mittel ist;
jedes R6 unabhängig-H, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Arylalkyl, Cycloalkylalkyl, Heterocycloalkyl,einen fluoreszierenden Rest, ein Radioisotop oder ein therapeutischesMittel ist;
R7 ist Wasserstoff, Alkyl,Alkenyl, Alkinyl, Arylalkyl, Cycloalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkylalkyl,Heterocycloalkyl, Cycloaryl, oder Heterocycloaryl ist, unsubstituiertoder mit R5 substituiert oder ein Teil einerRingstruktur mit einem D – Rest ist;
R8 istWasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Arylalkyl, Cycloalkyl, Heteroalkyl,Cycloalkylalkyl, Heterocycloalkyl, Cycloaryl oder Heterocycloaryl,unsubstituiert oder mit R5 substituiertoder ein Teil einer Ringstruktur mit einem E-Rest ist;
wobeiv und w jeweils unabhängig eine Ganzzahl von 1–1000darstellen;
und wobei x, y, und z jeweils unabhängigeine Ganzzahl von 1–10 sind; u eine Ganzzahl von 1–10ist; und
n eine Ganzzahl von 1–5 darstellt.
Ineinem Beispiel stellt mindestens einer von R1 undR2 ein Alkyl dar, unsubstituiert oder mitHalogen substituiert. In einem anderen Beispiel stellen sowohl R1 als auch R2 unabhängigeAlkyle dar, unubstituiert oder mit Halogen substituiert. In einigenBeispielen ist mindestens einer von R1 undR2 Methyl. In einem anderen Beispiel istR1 und R2 Methyl.
Ineinigen erfindungsgemäßen Beispielen ergeben x+ y + z mindestens 3. In anderen erfindungsgemäßenBeispielen ergeben x + y + z 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10. JederEinsatz von A, B, C, D oder E in einem Macrocyclus oder einem Vorläuferdavon wird einzeln ausgewählt. Beispielsweise umfasst eineSequenz, die durch die Formel [A]x dargestelltwird, in der x gleich 3 ist, Ausführungsformen, in denendie Aminosäuren nicht identisch sind, z. B. Gln-Asp-Alasowie Ausführungsformen, in denen die Aminosäurenidentisch sind, z. B. Gln-Gln-Gln. Dies gilt für alle Wertevon x, y oder z innerhalb der angegebenen Bereiche.
Ineinigen Ausführungsformen umfassen die erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Macrocyclen eine zweite Struktur, die eine α-Helixdarstellt und in der R8 -H darstellt unddamit eine interhelikale Wasserstoffbindung ermöglicht.In einigen Ausführungsformen stellen mindestens eins vonA, B, C, D oder E eine α,α-bisubstituierte Aminosäuredar. In einem Beispiel stellt B eine α,α-bisubstituierteAminosäure dar. Beispielsweise stellt mindestens eins vonA, B, C, D oder E eine 2-Amino-isobuttersäure dar. In anderenAusführungsformen stellt mindestens eins von A, B, C, Doder E eindar.
Inanderen Ausführungsformen wird die Länge der dieMacrocyclen bildenden Bindeglieder [-L1-S-L2-S-L3-], vom erstenCα bis zum zweiten Cα gemessen, so gewählt,dass sie eine gewünschte zweite Peptidstruktur stabilisiert,bespielsweise eine α-Helix, die aus Resten des peptidomimetischenMacrocyclus gebildet wird, einschließlich ohne Einschränkungderjenigen zwischen dem ersten Cα und einem zweiten Cα.
Macrocyclenoder Vorläufer von Macrocyclenn werden synthetisiert, beispielsweisein Verfahren, die Lösungsphasen oder Feststoffphasen verwendenund können sowohl natürlich vorkommende als auchkünstlich hergestellte Aminosäuren umfassen. Siehebeispielsweise Hunt, „The Non-Protein Amino Acids” inChemistry and Biochemistry of the Amino Acids, herausgegeben vonG. C. Barreff, Chapman and Hall, 1985. In einigen Ausführungsformenstellen die Thiolreste Seitenketten der AminosäureresteL-cystein, D-Cystein, α-Methyl-L-cystein, α-Methyl-D-cystein,L-Homocystein, D-Homocystein, α-Methyl-L-homocystein oder α-Methyl-D-homocysteindar. Ein bisalkylierendes Reagenz hat die allgemeine Formel X-L2-Y, in der L2 einenverbindenden Rest darstellt und X und Y Abgangsgruppen, die von-SH-Resten verdrängt werden, um Verbindungen mit L2 einzugehen. In einigen Ausführungsformenstellen X und Y Halogene wie I, Br oder Cl dar.
Inanderen Ausführungsformen werden D und/oder E in den Verbindungenmit der Formel I, II oder III weiter modifiziert, um eine Zellenaufnahmezu erleichtern. In einigen Ausführungsformen erleichterteine Lipidisierung oder PEG die Zellenaufnahme eines peptidomimetischenMacrocyclus, erhöht die Bioverfügbarkeit und erhöhtdas Vorhandensein im Blutkreislauf, verändert die Pharmacokinetik,reduziert die Immunogenität und/oder reduziert die benötigteVerabreichungsfrequenz.
Inanderen Ausführungsformen stellen mindestens eins von [D]und [E] in den Verbindungen mit der Formel I, II oder III einenRest dar, der ein zusätzliches macrocyclusbildendes Bindegliedaufweist, so dass der peptidomimetische Macrocyclus mindestens zweimacrocyclusbildende Bindeglieder aufweist. In einer bestimmten Ausführungsformumfasst ein peptidomimetischer Macrocyclus zwei macrocyclusbildendeBindeglieder.
Inden erfindungsgemäßen peptidomimetischen Macrocyclennkönnen alle hier beschriebenen Macrocyclus-formende Bindegliederzusammen mit anderen in den Tabellen 1–4 gezeigten Sequenzenverwendet werden sowie ebenfalls mit allen hier angegebenen R-Substituenten.
Ineinigen Ausführungsformen umfassen die peptidomimetischenMacrocyclen mindestens ein Helixmotiv. Beispielsweise A, B und/oderC in der Verbindung mit der Formel I, II oder III umfassen eineoder mehrere α-Helices. Im Allgemeinen umfassen α-Helices3 bis 4 Aminosäuren pro Windung. In einigen Ausführungsformenumfasst die α-Helix des peptidomimetischen Macrocycluss1 bis 5 Windungen und folglich 3 bis 20 Aminosäurereste.In bestimmten Ausführungsformen umfasst die α-Helix1 Windung, 2 Windungen, 3 Windungen, 4 Windungen oder 5 Windungen.In bestimmten Ausführungsformen stabilisiert das den Macrocyclus formendeBindeglied ein α-Helixmotiv, das sich in dem peptidomimetischenMacrocyclus befindet. Folglich wird in einigen Ausführungsformendie Länge des den Macrocyclus formenden Bindeglieds L vomersten Cα mm zweiten Cα so gewählt, dasssie die Stabilität einer α-Helix erhöht.In einigen Ausführungsformen umfasst das den Macrocyclusformende Bindeglied 1 bis 5 Windungen der α-Helix. In einigenAusführungsformen umfasst das den Macrocyclus formendeBindeglied etwa 1 Windung, 2 Windungen, 3 Windungen, 4 Windungenoder 5 Windungen der α-Helix. In einigen Ausführungsformenmisst die Länge des den Macrocyclus formenden Bindegliedsetwa 5 Å bis 9 Å pro Windung einer α-Helixoder etwa 6 Å bis 8 Å pro Windung einer α-Helix.Wenn sich das den Macrocyclus formende Bindeglied etwa auf 1 Windungeiner α-Helix erstreckt, entspricht die Längeetwa 5 C-C-Bindungen bis 13 C-C-Bindungen, etwa 7 C-C-Bindungenbis 11 C-C-Bindungen, oder etwa 9 Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen.Wenn sich das den Macrocyclus formende Bindeglied etwa auf 2 Windung einer α-Helixerstreckt, entspricht die Länge etwa 8 C-C-Bindungen bis16 C-C-Bindungen, etwa 10 C-C-Bindungen bis 14 C-C-Bindungen oderetwa 12 Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen. Wenn sich das den Macrocyclusformende Bindeglied etwa auf 3 Windung einer α-Helix erstreckt,entspricht die Länge etwa 14 C-C-Bindungen bis 22 C-C-Bindungen,etwa 16 C-C-Bindungen bis 20 C-C-Bindungen, oder etwa 18 Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen.Wenn sich das den Macrocyclus formende Bindeglied etwa auf 4 Windungeiner α-Helix erstreckt, entspricht die Längeetwa 20 C-C Bindungen bis 28 C-C-Bindungen, etwa 22 C-C-Bindungenbis 26 C-C-Bindungen oder etwa 24 Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen.Wenn sich das den Macrocyclus formende Bindeglied etwa auf 5 Windungeiner α-Helix erstreckt, entspricht die Längeetwa 26 C-C-Bindungen bis 34 C-C-Bindungen, etwa 28 C-C-Bindungenbis 32 C-C-Bindungen oder etwa 30 Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen.Wenn sich das den Macrocyclus formende Bindeglied etwa auf 1 Windungeiner α-Helix estreckt, enthält das Bindegliedetwa 4 Atome bis 12 Atome, etwa 6 Atome bis 10 Atome oder etwa 8Atome. Wenn sich das den Macrocyclus formende Bindeglied etwa auf2 Windungen einer α-Helix estreckt, enthält dasBindeglied etwa 7 Atome bis 15 Atome, etwa 9 Atome bis 13 Atomeoder etwa 11 Atome. Wenn sich das den Macrocyclus formende Bindegliedetwa auf 3 Windungen einer α-Helix estreckt, enthältdas Bindeglied etwa 13 Atome bis 21 Atome, etwa 15 Atome bis 19Atome oder etwa 17 Atome. Wenn sich das den Macrocyclus formendeBindeglied etwa auf 4 Windungen einer α-Helix estreckt,enthält das Bindeglied etwa 19 Atome bis 27 Atome, etwa 21Atome bis 25 Atome oder etwa 23 Atome. Wenn sich das den Macrocyclusformende Bindeglied etwa auf 5 Windungen einer α-Helixestreckt, enthält das Bindeglied etwa 25 Atome bis 33 Atome,etwa 27 Atome bis 31 Atome oder etwa 29 Atome. Wenn sich das denMacrocyclus formende Bindeglied etwa auf 1 Windung der α-Helixerstreckt, bildet der hier entstehende Macrocyclus einen Ring, deretwa 17 Glieder bis 25 Glieder, etwa 19 Glieder bis 23 Glieder oderetwa 21 Glieder enthält. Wenn sich das den Macrocyclusformende Bindeglied etwa auf 2 Windungen der α-Helix erstreckt,bildet der hier entstehende Macrocyclus einen Ring, der etwa 29 Gliederbis 37 Glieder, etwa 31 Glieder bis 35 Glieder oder etwa 33 Gliederenthält. Wenn sich das den Macrocyclus formende Bindegliedetwa auf 3 Windungen der α-Helix erstreckt, bildet derhier entstehende Macrocyclus einen Ring, der etwa 44 Glieder bis52 Glieder, etwa 46 Glieder bis 50 Glieder oder etwa 48 Gliederenthält. Wenn sich das den Macrocyclus formende Bindegliedetwa auf 4 Windungen der α-Helix erstreckt, bildet derhier entstehende Macrocyclus einen Ring, der etwa 59 Glieder bis67 Glieder, etwa 61 Glieder bis 65 Glieder oder etwa 63 Gliederenthält. Wenn sich das den Macrocyclus formende Bindegliedetwa auf 5 Windungen der α-Helix erstreckt, bildet derhier entstehende Macrocyclus einen Ring, der etwa 74 Glieder bis82 Glieder, etwa 76 Glieder bis 80 Glieder oder etwa 78 Gliederenthält.
Inanderen Ausführungsformen stellt die Erfindung peptidomimetischeMacrocyclen mit der Formel (IV) oder (IVa) bereit: wobei:
A, C, D und Ejeweils unabhängige natürliche oder nicht natürlicheAminosäuren darstellen;
B eine natürlicheoder nicht natürliche Aminosäure, ein Aminosäureanalog[-NH-L3-CO-],[-NH-L3-SO2-], oder[-NH-L3-] darstellt;
R1 undR2 unabhängig -H, Alkyl, Alkenyl,Alkinyl, Arylalkyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Heteroalkyl, oderHeterocycloalkyl sind, unsubstituiert oder mit Halogen substituiertoder Teile einer Ringstruktur mit einem E-Rest sind;
R3 Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Arylalkyl,Heteroalkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Cycloaryloder Heterocycloalkyl darstellt, unsubstituiert oder mit R5 substituiert;
L ein MacrocyclenformendesBindeglied mit der Formel -L1-L2-darstellt;
L1 und L2 unabhängigAlkylen, Alkenylen, Alkinylen, Heteroalkylen, Cycloalkylen, Heterocycloalkylen,Cycloarylen, Heterocycloarylen oder [-R4-K-R4-]n darstellen,jeweils wahlweise mit R5 substituiert;
wobeiR4 jeweils Alkylen, Alkenylen, Alkinylen,Heteroalkylen, Cycloalkylen, Heterocycloalkylen, Arylene oder Heteroarylendarstellen;
und K für O, S, SO, CO2,CO, CO2, oder CONR3 steht;
jedesR5 unabhängig ein Halogen, Alkyl,-OR6, -N(R6)2, -SR6, -SOR6, -SO2R6,-CO2R6, einen fluoreszierenden Rest,ein Radioisotop oder ein therapeutisches Mittel darstellt;
jedesR6 unabhängig -H, Alkyl, Alkenyl,Alkinyl, Arylalkyl, Cycloalkylalkyl, Heterocycloalkyl, einen fluoreszierendenRest, ein Radioisotop oder ein therapeutisches Mittel darstellt;
R7 Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Arylalkyl,Heteroalkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Cycloaryloder Heterocycloalkyl darstellt, umsubstituiert oder mit R5 substituiert;
v eine Ganzahl von 1–1000darstellt,
w eine Ganzahl von 1–1000 darstellt,
eine Ganzahl von 0–10 darstellt,
y eine Ganzahl von0–10 darstellt,
z eine Ganzahl von 0–10 darstellt,
neine Ganzahl von 1–5 darstellt,
Ineinem Beispiel stellt mindestens eins von R1 undR2 ein Alkyl dar, unsubstituiert oder mitHalogen substituiert. In einem anderen Beispiel stellen sowohl R1 als auch R2 unabhängigeAlkyle dar, umsubstituiert oder mit Halogen substituiert. In einigenBeispielen stellt mindestens einer der R1 undR2 Methyl dar. In anderen Beispielen stellenR1 und R2 Methyldar.
Ineinigen Beispielen der Erfindung ergeben x + y + z mindestens 3.In anderen erfindungsgemäßen Beispielen ergebenx + y + z 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10. Jeder Einsatz von A, B, C,D oder E in einem Macrocyclus oder einem Vorläufer davonwird einzeln ausgewählt. Beispielsweise umfasst eine Sequenz,die durch die Formel [A]x dargestellt wird, in der x gleich 3 ist,Ausführungsformen, in denen die Aminosäuren nichtidentisch sind, z. B. Gln-Asp-Ala sowie Ausführungsformen,in denen die Aminosäuren identisch sind, z. B. Gln-Gln-Gln. Diesgilt für alle Werte von x, y, oder z innerhalb der angegebenenBereiche.
Ineinigen Ausführungsformen umfassen die erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Macrocyclen eine zweite Struktur, die eine α-Helixdarstellt und in der R8 -H darstellt unddamit eine interhelikale Wasserstoffbindung ermöglicht.In einigen Ausführungsformen stellen mindestens eins vonA, B, C, D oder E eine α,α-bisubstituierte Aminosäuredar. In einem Beispiel stellt B eine α,α-bisubstituierteAminosäure dar. Beispielsweise stellt mindestens eine derA, B, C, D oder E eine 2-Amino-isobuttersäure dar. In anderenAusführungsformen stellt mindestens eins von A, B, C, Doder E eindar.
Inanderen Ausführungsformen wird die Länge des dieMacrocyclen bildenden Bindeglieds L, vom ersten Cα biszum zweiten Cα gemessen, so gewählt, dass sieeine gewünschte zweite Peptidstruktur stabilisiert, bespielsweiseeine α-Helix, die aus Resten des peptidomimetischen Macrocyclussgebildet wird, einschließlich ohne Einschränkungderjenigen zwischen dem ersten Cα und einem zweiten Cα.
Nachfolgendwerden Ausführungsbeispiele des Macrocyclen formenden BindegliedsL gezeigt.
Erfindungsgemäßepeptidomimetische Macrocyclen können mit einer Reihe demFachmann bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweisekönnen alle in den Tabellen 1, 2, 3 oder 4 mit „X” gekennzeichnetenReste mit einem Rest substituiert werden, der mit einem zweitenRest im selben Molekül einen Vernetzer bilden kann odereinen Vorläufer eines solchen Rests.
DerFachmann kennt verschiedene Verfahren, die zur Bildung von Macrocyclennführen. Beispielsweise wird die Bildung von peptidomimetischenMacrocyclenn mit der Formel I in Schafmeister et al., J.Am. Chem. Soc. 122: 5891–5892 (2000); Schafmeister Verdine, J. Am.Chem. Soc. 122: 5891 (2005); Walensky et al., Science305: 1466–1470 (2004); und US-Patent Nr. 7,192,713 beschrieben.Die α,α-disubstituierten Aminosäurenund Aminosäurevorläufer, die in den genanntenVerweisen offengelegt sind, können zur Synthese von Polypeptidendes peptidomimetischen Macrocyclusvorläufers verwendetwerden. Nach der Einbindung solcher Aminosäuren in Polypeptidvorläufernreagieren die endständigen Olefine mit einem Metathesekatalysator,was zur Bildung des peptidomimetischen Macrocyclus führt.In anderen Ausführungsformen verwended die Erfindung peptidomimetischeMacrocyclen mit der Formel (IV) oder (IVa): Verfahren zur Herstellungsolcher Macrocyclen werden beispielsweise im US-Patent Nr. 7,202,332 beschrieben.
Ineinigen Ausführungsformen beinhaltet die Synthese dieserpeptidomimetischen Macrocyclen einen mehrstufigen Prozess, der dieSynthese eines peptidomimetischen Vorläufers umfasst, dereinen Azidrest und einen Alkinrest enthält; danach wirdder peptidomimetische Vorläufer mit einem Macrocyclusreagenzzusammengebracht, um einen triazolgebundenen peptidomimetischenMacrocyclus zu bilden. Macrocyclen oder Vorläufer von Macrocyclennwerden synthetisiert, beispielsweise in Lösung oder anFeststoffphasen, und können sowohl natürlich vorkommendeals auch künstlich hergestellte Aminosäuren umfassen.Siehe beispielsweise Hunt, „The Non-Protein AminoAcids” in Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids,herausgegeben von G. C.. Barrett, Chapman und Hall, 1985.
Ineinigen Ausührungen wird ein Azid an den α-Kohlenstoffeines Rests gebunden und ein Alkin wird an den α-Kohlenstoffeines anderen Rests geknüpft. In einigen Ausführungsformenstellen die Azidreste Azidonachbildungen der AminosäurenL-Lysin, D-Lysin, Alpha-methyl-L-lysin, Alpha-methyl-D-lysin, L-Ornithin, D-Ornithin,Alpha-methyl-L-ornithin oder Alpha-methyl-D-ornithin dar. In anderenAusführungsformen stellt der Alkinrest L-Propargylglycindar. In weiteren Ausführungsformen stellt der Alkinresteine Aminosäure dar, die aus einer Gruppe gewältist, die L-Propargylglycin, D-Propargylglycin, (S)-2-Amino-2-methyl-4-pentinsäure, (R)-2-Amino-2-methyl-4-pentinsäure,(S)-2-Amino-2-methyl-5-hexinsäure, (R)-2-Amino-2-methyl-5-hexinsäure,(S)-2-Amino-2-methyl-6-heptinsäure, (R)-2-Amino-2-methyl-6-heptinsäure,(S)-2Aamino-2-methyl-7-octansäure, (R)-2-Amino-2-methyl-7-octansäure,(S)-2-Amino-2-methyl-8-nonsäure and (R)-2-Amino-2-methyl-8-nonsäureumfasst.
Ineinigen Ausführungsformen umfasst die Erfindung ein Verfahrenzur Synthese eines peptidomimetischen Macrocyclus, wobei das VerfahrenSchritte umfasst, in denen ein peptidomimetischer Vorläuferder Formel V oder Formel VI: mit einem Macrocyclusreagenzin Kontakt gebracht wird;
wobei v, w, x, y, z, A, B, C, D,E, R1, R2, R7, R8, L1 undL2 der Definition von Formel (II) entsprechen;R12 gleich -H ist, wenn das Macrocyclusreagenzein Cu-Reagenz darstellt und R12 gleich-H oder ein Alkyl ist, wenn das Macrocyclusreagenz ein Ru-Reagenzist; und wobei weiterhin dieser Schritt des Zusammenbringens zueiner unpolaren Verbindung zwischen dem Alkin- und dem Azidrestin Formel III oder Formel IV führt. Beispielsweise kannR12 ein Methyl darstellen, wenn das Macrocyclusreagenzein Ru-Reagenz darstellt.
Inden erfindungsgemäßen peptidomimetischen Macrocyclenstellt mindestens eins von R1 und R2 unabhängige Alkyl, Alkenyl, Alkinyl,Arylalkyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Heteroalkyl, oder Heterocycloalkyldar, mit halogen substituiert oder nicht; in einigen Ausführungsformenstellen sowohl R1 als auch R2 unabhängige Alkyl,Alkenyl, Alkinyl, Arylalkyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Heteroalkyl,oder Heterocycloalkyl dar, unsubstituiert oder mit Halogen substituiert;In einigen Ausführungsformen stellen mindestens eins vonA, B, C, D oder B eine α,α-bisubstituierte Aminosäuredar. In einem Beispiel stellt B eine α,α-bisubstituierteAminosäure dar. Beispielsweise stellt mindestens eins vonA, B, C, D oder B eine 2-Amino-isobuttersäure dar.
Ineinem Beispiel stellt mindestens eins von R1 undR2 ein Alkyl dar, unsubstituiert oder mitHalogen substituiert. In einem anderen Beispiel stellen sowohl R1 als auch R2 unabhängigAlkyl dar, unsubstituiert oder mit Halogen substituiert. In einigenBeispielen stellt mindestens eins von R1 undR2 Methyl dar. In einem anderen Beispielstellen R1 und R2 Methyldar. Das Macrocyclusreagenz kann ein Cu-Reagenz oder ein Ru-Reagenzdarstellen.
Ineinigen Ausführungsformen wird der peptidomimetische Vorläufervor dem Zusammenbringen gereinigt. In anderen Ausführungsformenwird der peptidomimetische Macrocyclus nach dem Zusammenbringen gereinigt.In wieder anderen Ausführungsformen wird der peptidomimetischeMacrocyclus nach dem Zusammenbringen gefaltet. Das Verfahren kannin Lösung erfolgen, alternativ kann das Verfahren aberauch an einer Festphase durchgeführt werden.
Esist auch vorstellbar, das erfidungsgemäße Verfahrenin Gegenwart eines Zielmakromoleküls durchzuführen,das an den peptidomimetischen Vorläufer oder den peptidomimetischenMacrocyclus unter diese Bindung begünstigenden Bedingungenanknüpft. In einigen Ausführungsformen wird dasVerfahren in Gegenwart eines Zielmakromoleküls durchgeführt,das bevorzugt an den peptidomimetischen Vorläufer oderden peptidomimetischen Macrocyclus unter diese Bindung begünstigendenBedingungen anknüpft. Das Verfahren kann auch angewandetwerden, um eine Bibliothek an peptidomimetischen Macrocyclen zusynthetisieren.
Ineinigen Ausführungsformen stellt der Alkinrest des peptidomimetischenVorläufers mit der Formel V oder der Formel VI eine Seitenketteeiner Aminosäure dar, die aus einer Gruppe gewältist, die L-Propargylglycin, D-Propargylglycin, (S)-2-Amino-2-methyl-4-pentinsäure,(R)-2-Amino-2-methyl-4-pentinsäure, (S)-2-Amino-2-methyl-5-hexinsäure,(R)-2-Amino-2-methyl-5-hexinsäure, (S)-2-Amino-2-methyl-6-heptinsäure, (R)-2-Amino-2-methyl-6-heptinsäure,(S)-2-Amino-2-methyl-7-octinsäure, (R)-2-Amino-2-methyl-7-octinsäure, (S)-2-Amino-2-methyl-8-noninsäureund (R)-2-Amino-2-methyl-8-noninsäure umfasst. In anderenAusführungsformen stellt der Azidrest des peptidomimetischenVorläufers mit der Formel V oder der Formel VI eine Seitenketteeiner Aminosäure dar, die aus einer Gruppe gewähltist, die ε-Azido-L-lysin, ε-Azido-D-lysin, ε-Azido-α-methyl-L-lysin, ε-Azido-α-methyl-D-lysin, δ-Azido-α-methyl-L-ornithinund δ-Azido-α-methyl-D-ornithin umfasst.
Ineinigen Ausführungsformen ist x + y + z gleich 3, und A,B und C sind unabhängige natürliche oder nichtnatürliche Aminosäuren. In einigen Ausführungsformenist x + y + z gleich 6, und A, B und C sind unabhängigenatürliche oder nicht natürliche Aminosäuren.
Ineinigen Ausführungsformen von erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Macrocyclenn umfassen [D]v,und/oder [E]w zusätzliche Macrocyclenoder Macrocyclusstrukturen. Beispielsweise kann [D]v diefolgende Formel aufweisen: wobei A, C, D\' und E jeweilsunabhängig natürliche oder nicht natürlicheAminosäuren darstellen;
B eine natürlicheoder nicht natürliche Nachbildung Aminosäure oder-Analog[-NH-L3-CO],[-NH-L3-SO2-] oder[-NH-L3-] darstellt;
R1 und R2 unabhängig-H, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Arylalkyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl,Heteroalkyl, oder Heterocycloalkyl sind, unsubstituirt oer mit Halogensubstituiert oder Teile einer Ringstruktur mit einem E-Rest;
R3 Wasserstoff darstellt, Alkyl, Alkenyl,Alkinyl, Arylalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Cycloalkylalkyl,Cycloaryl oder Heterocycloalkyl, unsubstituiert oder mit R5 substituiert;
L1,und L2 unabhängig Alkylen, Alkenylen,Alkinylen, Heteroalkylen, Cycloalkylen, Heterocycloalkylen, Cycloarylen,Heterocycloarylen oder [-R4-K-R4-]ndarstellen, jeweils unsubstituiert oder mit R5 substituiert;
wobeiR4 jeweils Alkylen, Alkenylen, Alkinylen,Heteroalkylen, Cycloalkylen, Heterocycloalkylen, Arylen oder Heteroarylendarstellt;
und K für O, S, SO, SO2,CO, CO2 oder CONR3 steht;
jedesR5 unabhängig Halogen, Alkyl, -OR6, -N(R6)2, -SR6, -SOR6, -SO2R6,-CO2R6, einen fluoreszierendenRest, ein Radioisotop oder ein therapeutisches darstellt;
jedesR6 unabhängig -H, Alkyl, Alkenyl,Alkinyl, Arylalkyl, Cycloalkylalkyl, Heterocycloalkyl, einen fluoreszierendenRest, ein Radioisotop oder ein therapeutisches Mittel darstellt;
R7 Wasserstoff darstellt, Alkyl, Alkenyl,Alkinyl, Arylalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Cycloalkylalkyl,Cycloaryl oder Heterocycloalkyl, unsubstituiert oder mit R5 substituiert;
v eine Ganzzahl von1–1000 darstellt.
w eine Ganzzahl von 1–1000darstellt; und
x eine Ganzzahl von 0–10 darstellt.
Ineiner anderen Ausführung hat [E]w dieFormel: wobei die Substituenten wieim vorhergehenden Abschnitt definiert sind.
Ineinigen Ausführungsformen wird der Schritt des Zusammenbringenin einem Lösungsmittel durchgeführt, das aus einerGruppe ausgewählt wird, die aus protischen, wässrigen,organischen Lösungsmitteln und Mischungen bestehen. Beispielsweisekann das Lösungsmittel aus einer Gruppe gewähltwerden, bestehend aus H2O, THF, THF/H2O, tBuOH/H2O, DMF,DIPEA, CH3CN oder CH2Cl2, ClCH2CH2Cl oder Mischungen daraus. Das Lösungsmittelkann eines sein, das die Helixbildung fördert.
Anderegleichwertige Schutzgruppen, Abgangsgruppen oder Reagenzien werdensubstituiert, und bestimmte synthetische Schritte werden in andererReihenfolge oder Sequenz ausgeführt, um die gewünschten Verbindungenherzustellen. Synthetische chemische Umwandlungen und Verfahrenzu Schutzgruppen (Aktivierung und Deaktivierung von Schutzmaßnahmen)zur Synthetisierung der hier beschriebenen Verbindungen, umfassenbeispielsweise die in Larock, Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers (1989); Greene and Wuts, ProtectiveGroups in Organic Synthesis, 2d. Hrsg., John Wiley and Sons (1991); Fieserand Fieser, Fieser and Fieser\'s Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons (1994); and Paquette, Hrsg., Encyclopediaof Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995) undspäteren Ausgaben davon beschrieben sind.
Dieerfindungsgemäßen peptidomimetischen Macrocyclenwerden beispielsweise durch chemische Syntheseverfahren hergestelltwie in Fields et al., Kapitel 3 in Synthetic Peptides: AUser\'s Guide, Hrsg. Grant, W. H. Freeman Co., New York, N. Y., 1992, Seite77 beschrieben. Folglich werden Peptide beispielsweise mitder automatischen Merrifieldtechnik auf festen Phasesn synthetisiert,wobei die Amine, entweder durch tBoc- oder Fmoc-Chemie geschütztwerden unter Verwendung von seitenkettengeschützten Aminosäuren, zumBeispiel einem automatischen Peptidsynthesizer (z. B., Applied Biosystems(Foster City, CA), Model 430A, 431, oder 433).
EineForm der Herstellung peptidomimetischer Vorläufer und peptidomimetischerMacrocyclen, das hier beschrieben wird, verwended eine Festphasen-Peptidsynthese(SPPS). Die C-terminale Aminosäure ist über einesäurelabile Bindung mit einem Linker an ein vernetztesPolystyrolharz geknüpft. Dieses Harz ist unlöslichin den zur Synthese verwendeten Lösungsmitteln, wodurch überschüssigeReagenzien und Nebenprodukte relativ einfach und schnell ausgewaschenwerden können. Der N-Terminus wird mit der säurestabilen Fmoc-Gruppegeschützt, aber mit Base entfernt werden kann. FunktionelleGruppen der Seitenketten werden gegebenenfalls mit basestabilen,säurelabilen Gruppen geschützt.
Längerepeptidomimetische Vorläufer werden beispielsweise hergestellt,indem einzel hergestellte synthetische Peptide mittels einer natürlichenchemischen Ligation verbunden werden. Alternativ könnenlängere synthetische Peptide biologisch mittels bekannterrekombinanter DNS und Protein Expressionsverfahren synthetisiertwerden. Solche Techniken sind aus bekannten Standard-Nachschlagewerkenmit detaillierten Vorschriften bekannt. Um ein Gen herzustellen,das einen erfindungsgemäßen peptidomimetischenVorläufer kodiert, wird die Aminosäurensequenzrückübersetzt, um eine Nuldeinsäuresequenzzu erhalten, die die Aminosäuresequenz kodiert, bevorzugtmit Codons, die für den Organismus ideal sind, in dem dasGen exprimiert werden soll. Danach wird ein synthetisches Gen hergestellt,normalerweise durch Synthese von Oligonuldeotiden, die das Peptidund gegebenenfalls andere Steuerelemente kodieren. Das synthetischeGen wird in einen geeigneten Klonvektor eingebracht und in eineWirtszelle transfiziert. Das Peptid wird dann unter fürdas gewählte Expressionssystem und den Wirt geeignetenBedingungen exprimiert. Das Peptid wird gereinigt und mittels Standardverfahrencharakterisiert.
Diepeptidomimetischen Vorläufer werden beispielsweise durchHigh-Throughput kombinatorisch hergestellt, wobei beispielsweiseein kombinatorischer Hight-Throughput Mehrkanalsynthesizer verwendetwird (z. B. Thuramed TETRAS multichannel Peptide synthesizer vonCreoSalus, Louisville, KY oder Model Apex 396 multichannel Peptidesynthesizer von AAPPTEC, Inc., Louisville, KY).
Diefolgenden Syntheseschemen werden nur zu Verdeutlichung der vorliegendenErfindung verwendet und sollen den hier beschriebenen Umfang derErfindung nicht einschränken. Um die Zeichnung zu vereinfachen,stellt der gezeigte Ablauf die Azidoaminosäureanaloga ε-Azido-α-methyl-L-lysinund ε-Azido-α-methyl-D-lysin dar, sowie die AlkinaminosäureanalogaL-propargylglycin, (S)-2-Amino-2-methyl-4-pentinsäure und(S)-2-Amino-2-methyl-6-heptinsäure. Folglich stellen inden folgenden Syntheseschemen R1, R2, R7 und R8 jeweils -H dar; L1 jeweils-(CH2)4-; und L2 jeweils -(CH2)-.Wie schon in obiger genauer Beschreibung der Erfindung stets angemerkt,können viele andere Aminosäureanaloga verwendetwerden, in denen R1, R2,R7, R8, L1 und L2 unabhängigaus den verschiedenen hier offengelegten Strukturen gewähltwerden. Synthetisierungsschema1:
Syntheseschema1 beschreibt die Herstellung verschiedener erfindungsgemäßerVerbindungen. Ni(II)-Komplexe aus Schiffbasen, von den chiralenHilfsstoffen (S)-2-[N-(N\'-benzylprolyl)amino]-benzophenon (BPB)abgeleitet und Aminosäuren wie Glycin oder Alanin werdenhergestellt wie in Belokon et al. (1998), Tetrahedron Asymm.9: 4249–4252 beschrieben. Die entstehenden Komplexewerden danach mit Alkylierungsreagenzien umgesetzt, die einen Azidooder Alkinylrest aufweisen, um Enantiomer angereicherte erfindungsgemäßeVerbindungen zu erhalten. Falls gewünscht könnendie entstehenden Verbindungen zur Verwending in Peptidsynthesengeschützt werden. Syntheseschema2:
ImStandardverfahren zur Synthese peptidomimetischer Macrocyclen, imSyntheseschema 2 dargestellt, enthält der peptidomimetischeVorläufer einen Azidrest und einen Alkinrest und wird durchFlüssigerphase- oder Festphase-Peptidsynthese (SPPS) synthetisiert,wobei handelsübliche Aminosäuren N-α-Fmoc-L-propargylglycinund die mit N-α-Fmoc geschützten Formen der Aminosäuren(S)-2-Amino-2-methyl-4-pentinsäure, (S)-2-Amino-6-heptinsäure,(S)-2-Amino-2-methyl-6-heptinsäure, N-Methyl-ε-azido-L-lysin undN-Methyl-ε-azido-D-lysin verwendet werden. Der peptidomimetischeVorläufer wird dann entschützt und von dem Festphasenharzunter Standardbedingungen abgespalten (z. B. starke Säuren,wie 95% TFA). Der peptidomimetische Vorläufer wird alsRohmischung zur Reaktion gebracht oder wird vor der Reaktion miteinem Macrocyclusreagenz gereinigt, wie beispielsweise mit einemCu(I) in organischer or wässriger Lösung (Rostovtsevet al. (2002), Angew. Chem. Int. Ed. 41: 2596–2599; Tornoeet al. (2002), J. Org. Chem. 67: 3057–3064; Deiterset al. (2003), J. Am. Chem. Soc. 125: 11782–11783; Punnaet al. (2005), Angew. Chem. Int. Ed. 44: 2215–2220).In einer Ausführungsform wird die triazolbildende Reaktionunter Bedingungen ausgeführt, die die α-Helix-Bildungfördern. Beispielsweise kann das Lösungsmittelaus einer Gruppe gewählt werden, die aus of H2O,THF, CH3CN, DMF, DIPEA, tBuOH, oder Mischungendaraus besteht. In einer anderen Ausführungsform wird dieMacrocyclusbildung in DMF durchgeführt. In einigen Ausführungsformenwird die Macrocyclusbildung in einer gepufferten wässrigenoder teilweise wässrigen Lösung durchgeführt. Syntheseschema3:
ImStandardverfahren zur Synthese peptidomimetischer Macrocyclen, imSyntheseschema 3 dargestellt, enthält der peptidomimetischeVorläufer einen Azidrest und einen Alkinrest und wird mittelsFestphasen-Peptidsynthese (SPPS) synthetisiert, wobei handelsüblicheAminosäuren N-α-Fmoc-L-Propargylglycin und diemit N-α-Fmoc geschützten Formen der Aminosäuren(S)-2-Amino-2-methyl-4-pentinsäure, (S)-2-Amino-6-heptinsäure,(S)-2-Amino-2-methyl-6-heptinsäure, N-Methyl-ε-azido-L-lysinund N-Methyl-ε-azido-D-lysin verwendet werden. Der peptidomimetischeVorläufer wird als Rohmischung mit einem Macrocyclusreagenz, beispielsweiseeinem Cu(I)-Reagenz auf dem Harz in Reaktion gebracht (Rostovtsevet al. (2002), Angew. Chem. Int. Ed. 41: 2596–2599; Tornoeet al. (2002), J. Org. Chem. 67: 3057–3064; Deiterset al. (2003), J. Am. Chem. Soc. 125: 11782–11783; Punnaet al. (2005), Angew. Chem. Int. Ed. Der entstehende triazolhaltigepeptidomimetische Macrocyclus wird dann entschützt undvon dem Festphasenharz unter Standardbedingungen abgespalten (z.B. starke Säuren, wie 95% TFA). In einigen Ausführungsformenwird die Macrocyclusbildung in einem Lösungsmittel durchgeführt,das aus einer Gruppe gewählt wird, die aus CH2Cl2, ClCH2CH2Cl, DMF, THF, NMP, DIPEA, 2,6-Lutidin, Pyridin,DMSO, H2O oder Mischungen daraus besteht.In einigen Ausführungsformen wird die Macrocyclusbildungin einer gepufferten wässrigen oder teilweise wässrigenLösung durchgeführt. Syntheseschema4:
ImStandardverfahren zur Synthese peptidomimetischer Macrocyclen, imSynthetisierungsschema 4 dargestellt, enthält der peptidomimetischeVorläufer einen Azidrest und einen Alkinrest und wird durchFlüssigphase oder Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) synthetisiert,wobei handelsübliche Aminosäuren N-α-Fmoc-L-propargylglycinund die mit N-α-Fmoc geschützten Formen der Aminosäuren(S)-2-Amino-2-methyl-4-pentinsäure, (S)-2-Amino-6-heptinsäure,(S)-2-Amino-2-methyl-6-heptinsäure, N-Methyl-ε-azido-L-lysin undN-Methyl-ε-azido-D-lysin verwendet werden. Der peptidomimetischeVorläufer wird dann entschützt und vom Festphasenharzunter Standardbedingungen abgespalten (z. B. starke Säuren,wie 95% TFA). Der peptidomimetische Vorläufer wird alsRohmischung umgesetzt oder vor der Reaktion mit einem Macrocyclenbildenden Reagenz ie einem Ru(II)-Reagenz, wie beispielsweise Cp·RuCl(PPh3)2 oder [Cp·RuCl]4 gereinigt (Rasmussen et al. Org.Lett. 9: 5337–5339; Zhang et al. (2005),J. Am. Chem. Soc. 127: 15998–15999). In einigen Ausführungsformenwird der Schritt der Macrocyclusbildung in einem Lösungsmitteldurchgeführt, das aus der Gruppe gewählt wird,die DMF, CH3CN und THF enthält. Syntheseschema5:
ImStandardverfahren zur Synthese peptidomimetischer Macrocyclen, imSyntheseschema 5 dargestellt, enthält der peptidomimetischeVorläufer einen Azidrest und einen Alkinrest und wird ineiner Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) synthetisiert, wobei diehandelsübliche Aminosäure N-α-Fmoc-L-Propargylglycin unddie mit N-α-Fmoc geschützten Formen der Aminosäuren(S)-2-Amino-2-methyl-4-pentinsäure, (S)-2-Amino-6-heptinsäure,(S)-2-Amino-2-methyl-6-heptinsäure, N-Methyl-ε-azido-L-lysinund N-Methyl-ε-azido-D-lysin verwendet werden. Der peptidomimetischeVorläufer wird als Rohmischung mit einem Macrocyclusreagenz aufdem Harz umgesetzt, beispielsweise einem Ru(II)-Reagenz. Das Reagenzkann beispielsweise Cp·RuCl(PPh3)2 oder [Cp·RuCl]4 sein(Rasmussen et al. (2007), Org. Lett. 9: 5337–5339; Zhanget al. (2005), J. Am. Chem. Soc. 127: 15998–15999).In einigen Ausführungsformen wird der Schritt der Macrocyclusbildungin einem Lösungungsmittel durchgeführt, ausgewähltaus der Gruppe, die CH2Cl2,ClCH2CH2Cl, CH3CN, DMF und THF enthält.
MehrereBeispiele von peptidomimetischen Macrocyclenn werden in Tabelle5 gezeigt. ”Nle” steht für Norleucinund ersetzt einen Methioninrest. Die Verwendung ähnlicherBindeglieder is denkbar, um peptidomimetische Macrocyclen auf Basisder in den Tabellen 1 bis 4 offengelegten Polypeptidsequenzen zusynthetisieren. TABELLE5 Tabelle 5 zeigt Beispiele erfindungsgemäßerpeptidommimetischer Macrocyclen. ”Nle” steht fürNorleucin.
Dievorliegende Erfindung sieht die Verwendung von in der Natur nichtvorkommenden Aminosäuren und Aminosäureanalogain der Synthese der hier beschriebenen peptidomimetischen Macrocyclenvor. Aminosäuren oder Aminosäureanaloga, die mitden Syntheseverfahren kompatibel sind, die zur Synthese von stabilentriazolhaltigen peptidomimetischen Macrocyclen dienen, könnenin der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel, L-Propargylglycinkommt als nützliche Aminosäure in der vorliegendenErfindung in Betracht. Allerdings sind andere alkinhaltige Aminosäurenebenfalls nützlich für die Erfindung, die eineandere Aminosäuren-Seitenkette aufweisen. Beispielsweiseenthält L-Propargylglycin eine Methyleneinheit zwischen dem α-Kohlenstoffder Aminosäure und dem Allein der Aminosäure-Seitenkette.Die Erfindung zieht ebenfalls die Verwendung von Aminosäurenmit mehreren Methyleneinheiten zwischen dem α-Kohlenstoffund dem Allein in Betracht. Eine Azidoanalog der AminosäurenL-Lysin, D-Lysin, Alpha-Methyl-L-lysin und Alpha-Methyl-D-lysinwerden auch in Betracht gezogen als nützliche Aminosäurender vorliegenden Erfindung. Allerdings sind andere terminale Azidoaminosäurenebenfalls nützlich für die Erfindung, die eineandere Aminosäuren-Seitenkette aufweisen. Beispielsweiseenthält das Azidoanalog von L-Lysin vier Methyleneinheitenzwischen dem α-Kohlenstoff der Aminosäure unddem terminalen Azid der Aminosäureseitenkette. Die Erfindung umfasstauch die Verwendung von Aminosäuren mit weniger oder mehrals vier Methyleneinheiten zwischen dem α-Kohlenstoff unddem terminalen Azid. Tabelle 6 zeigt einige Aminosäuren,die bei der Herstellung von erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Macrocyclenn nützlich sind. TABELLE Tabelle 6 zeigt beispielhaft einige Aminosäuren,die bei der Herstellung von erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Macrocyclen nützlich sind.
Ineinigen Ausführungsformen haben die Aminosäurenund die Aminosäureanaloga die D-Konfiguration. In anderenAusführungsformen zeigen sie eine L-Konfiguration. In manchenAusführungsformen haben einige der Aminosäurenund Aminosäureanaloga, die im Peptidomimetikum enthaltensind, die D-Konfiguration, wobei einige der Aminosäurenund Aminosäureanaloga die L-Konfiguration aufweisen. Ineinigen Ausführungsformen sind die Aminosäureanaloga α,α-bisubstituiert,z. B. als α-Methyl-L-propargylglycin, α-Methyl-D-propargylglycin, ε-Azido-alpha-methyl-L-lysinund ε-Azido-alpha-methyl-D-lysin. In einigen Ausführungsformensind die Aminosäuren N-alkyliertt, z. B., N-methyl-L-Propargylglycin,N-Methyl-D-propargylglycin, N-Methyl-ε-azido-L-lysin undN-Methyl-ε-azido-D-lysin.
Ineinigen Ausführungsformen ist der -NH-Rest der Aminosäuremit einer Schutzgruppe geschützt, einschließlichohne Einschränkung -Fmoc und -Boc. In anderen Ausführungsformenist die Aminosäure vor der Synthese des peptidomimetischenMacrocyclus nicht geschützt.
Inanderen Ausführungsformen verwended die Erfindung peptidomimetischeMacrocyclen mit der Formel III: Die folgenden Syntheseschemen beschreibendie Herstellung dieser Verbindungen. Um die Zeichnung zu vereinfachen,stellen die schematischen Darstellungen Aminosäureanalogadar, die von L- oder D-Cystein abgeleitet wurden, in denen L1 und L3 beide -(CH2)- darstellen. Wie schon in obiger Beschreibungder Erfindung in Einzelnen stets angemerkt, können vieleandere Aminosäureanaloga verwendet werden, in denen L1 und L3 unabhängigaus den verschiedenen hier offengelegten Strukturen gewähltwerden. Die Symbole „[AA]m”, „[AA]n”, „[AA]o” repräsentiereneine Sequenz von amidvernetzten Resten, wie natürlichenoder künstlichen Aminosäuren. Wie bereits obenbeschrieben, ist jedes Vorkommen von „AA” unabhängigvon anderen vorkommenden „AA”, und eine Formelwie „[AA]m” umfasst beispielsweiseSequenzen nicht-identischer Aminosäuren sowie Sequenzenidentischer Aminosäuren. Syntheseschema6:Bilderklärung: solid support= Fester Träger
InSchema 6 enthält der peptidomimetische Vorläuferzwei -SH–Reste und wird durch Festphasen-Peptidsynthese(SPPS) synthetisiert, in der handelsübliche N-α-FmocAminosäuren verwendet werden, wie N-α-Fmoc-S-Trityl-L-cysteinoder N-α-Fmoc-S-trityl-D-cystein. Alpha-methylierte Versionenvon D-Cystein oder L-Cystein werden mit bekannten Verfahren hergestellt(Seebach et al. (1996), Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35:2708–2748, und anderen hier angegebenen Verweisen)und dann in die entsprechenden geschützten N-α-Fmoc-S-Trityl-Monomereunter Verwendung bekannter Verfahren umgewandelt („BioorganicChemistry: Peptides and Proteins”, Oxford University Press,New York: 1998, dessen gesamter Inhalt ist hiermit per Bezugnahmeaufgenommen). Der peptidomimetische Vorläufer wird dannentschützt und vom Festphasenharz unter Standardbedingungenabgespalten (z. B. starke Säuren, wie 95% TFA). Der peptidomimetische Vorläuferwird als Rohmischung zur Reaktion gebracht oder vor der Reaktionmit X-L2-Y in organischen oder wässrigenLösungen gereinigt. In einigen Ausführungsformenwird die Alkylierung unter verdünnten Bedingungen durchgeführt(z. B. 0,15 mmol/L), um die Macrocyclusbildung zu fördernund eine Polymerisation zu verhindern. In einigen Ausführungsformenwird die Alkylierung in organischen Lösungsmitteln durchgeführt,wie flüssigem NH3 (Mosberget al. (1985), J. Am. Chem. Soc. 107: 2986–2987; Szewczuket al. (1992), Int. J. Peptide Protein Res. 40: 233–242),NH3/MeOH, oder NH3/DMF(Or et al. (1991), J. Org. Chem. 56: 3146–3149). Inanderen Ausführungsformen wird die Alkylierung in einerwässrigen Lösung durchgeführt, wie 6MGuanidinium HCL, pH 8 (Brunel et al. ((2005) Chem. Commun.(20): 2552–2554). In anderen Ausführungsformenist das Lösungsmittel, das für die Alkylierungverwendet wird, DMF oder Dichloroethan. Syntheseschema7:
InSchema 7 enthält das Vorläufer-Peptidomimetikumzwei oder mehr -SH-Einheiten, von denen zwei spezielle Schutzgruppentragen, die eine selektive Entschützung und anschließendeAlkylierung zur Schließung des Makrocyclus ermöglichen.Das Vorläufer-Peptidomimetikum wird durch Festphasenpeptidsynthese (SPPS)unter Verwendung im Handel erhältlicher N-α-Fmoc-geschützterAminosäuren wie beispielsweise N-α-Fmoc-S-p-methoxytrityl-L-cysteinoder N-α-Fmoc-S-p-methoxytrityl-D-cystein hergestellt.In Alpha-Stellung methylierte Derivate von D-Cystein oder L-Cysteinsind durch bekannte Methoden zugänglich (Seebach etal. (1996), Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 2708–2748 unddarin enthaltene Literaturverweise) und werden anschließendnach bekannten Verfahren in die entsprechend geschütztenN-α-Fmoc-S-p-methoxytrityl-Monomere überführt(Bioorganic Chemistry: Peptides and Proteins, Oxford UniversityPress, New York: 1998, das in seiner Gesamtheit durch diesenVerweis hierin aufgenommen wird). Die Mmt-Schutzgruppe des peptidomimetischenVorläufers wird dann unter Standardbedingungen abgespalten(z. B. milde Säure, wie beispielsweise 1% TFA in DCM).Das Vorläufer-Peptidomimetikum wird dann am Harz mit X-L2-Y in organischen Lösung umgesetzt.Beispielsweise kann die Reaktion in Gegenwart einer sterisch gehindertenBase, wie beispielsweise Diisopropylethylamin durchgeführtwerden. In einigen Ausführungsformen findet die Alkylierungin organischen Lösungen, wie beispielsweise flüssigemNH3, (Mosberg et al. (1985), J.Am. Chem. Soc. 107: 2986–2987; Szewczuket al. (1992), Int. J. Peptide Protein Res. 40: 233–242),NH3/MeOH oder NH3/DMF(Or et al. (1991), J. Org. Chem. 56: 3146–3149)statt. In anderen Ausführungsformen findet die Alkylierungin DMF oder Dichloroethan statt. Anschließende werden dieSchutzgruppen vom peptidomimetischen Makrocyclus entfernt und daserhaltene Reaktionsprodukt wird unter Standardbedingungen von derFestphase abgespalten (z. B. starke Säure, wie beispielsweise95% TFA). Syntheseschema8:
InSchema 8 enthält das Vorläufer-Peptidomimetikumzwei oder mehr -SH-Einheiten, von denen zwei spezielle Schutzgruppentragen, die eine selektive Entschützung und anschließendeAlkylierung zur Schließung des Makrocyclus ermöglichen.Das Vorläufer-Peptidomimetikum wird durch Festphasenpeptidsynthese (SPPS)unter Verwendung im Handel erhältlicher N-α-Fmoc-geschützterAminosäuren wie beispielsweise N-α-Fmoc-S-p-methoxytrityl-L-cysteinoder N-α-Fmoc-S-p-methoxytrityl-D-cystein, N-α-Fmoc-S-S-t-butyl-L-cysteinund N-α-Fmoc-S-S-t-butyl-D-cystein hergestellt. In Alpha-Stellungmethylierte Derivate von D-Cystein oder L-Cystein sind durch bekannteMethoden zugänglich (Seebach et al. (1996), Angew.Chem. Int. Ed. Engl. 35: 2708–2748 und darin enthalteneLiteraturverweise) und werden anschließend nach bekanntenVerfahren in die entsprechend geschützten N-α-Fmoc-S-p-methoxytrityl-oder N-α-Fmoc-S-S-t-butyl Monomere (BioorganicChemistry: Peptides and Proteins, Oxford University Press, New York:1998, das in seiner Gesamtheit durch diesen Verweis hierinaufgenommen wird) überführt. Die S-S-tButyl-Schutzgruppedes peptidomimetischen Vorläufers wird nach bekannten Verfahrenselektiv abgespalten (z. B. 20% 2-Mercaptoethanol in DMF, siehe: Galandeet al. (2005), J. Comb. Chem. 7: 174–177). DasVorläufer-Peptidomimetikum wird dann am Harz mit einemmolaren Überschuss an X-L2-Y inorganischer Lösung umgesetzt. Beispielsweise kann die Reaktionin Gegenwart einer sterisch gehinderten Base, wie beispielsweiseDiisopropylethylamin durchgeführt werden. Die Mmt-Schutzgruppedes peptidomimetischen Vorläufers wird dann unter Standardbedingungen abgespalten(z. B. milde Säure, wie beispielsweise 1% TFA in DCM).Der peptidomimetische Vorläufer wird dann durch Versetzenmit einer sterisch gehinderten Base in organischer Lösungam Harz zyklisiert. In einigen Ausführungsformen findetdie Alkylierung in organischen Lösungen, wie beispielsweise NH3/MeOH oder NH3/DMF,statt (Or et al. (1991), J. Org. Chem. 56: 3146–3149).Anschließend werden die Schutzgruppen vom peptidomimetischenMakrocyclus entfernt und das erhaltene Reaktionsprodukt wird unterStandardbedingungen von der Festphase gespalten (z. B. starke Säure,wie beispielsweise 95% TFA) Syntheseschema9:
InSchema 9 enthält der peptidomimetische Vorläuferzwei L-Cystein-Einheiten. Der peptidomimetische Vorläuferwird durch bekannte biologische Expressionssysteme in lebenden Zellenoder durch bekannte zellenfreie Expressionsverfahren in vitro hergestellt.Das Vorläufer-Peptidomimetikum wird als Rohgemisch weiterumgesetzt oder es wird vor der Umsetzung mit X-L2-Y in organischenoder wässrigen Lösungen gereinigt. In einigenAusführungsformen wird die Alkylierung in verdünnterLösung durchgeführt (d. h. 0,15 mmol/L), um dieMakrozyklisierung zu begünstigen und Polymerisation zuvermeiden. In einigen Ausführungsformen wird die Alkylierungin organischen Lösungen wie beispielsweise flüssigemNH3 (Mosberg et al. (1985), J. Am. Chem.Soc. 107: 2986–2987; Szewczuk et al. (1992),Int. J. Peptide Protein Res. 40: 233–242), NH3/MeOH oder NH3/DMF(Or et al. (1991), J. Org. Chem. 56: 3146–3149)durchgeführt. In anderen Ausführungsformen wirddie Alkylierung in wässriger Lösung wie beispielsweise6M Guanidinium-HCL, pH 8 durchgeführt (Brunel etal. (2005), Chem. Commun. (20): 2552–2554). Inanderen Ausführungsformen wird die Alkylierung in DMF oderDichloroethan durchgeführt. In einer weiteren Ausführungsformwird die Alkylierung in nicht-denaturierenden wässrigenLösungen durchgeführt, und in einer wieder anderenAusführungsform wird die Alkylierung unter Bedingungendurchgeführt, die die Bildung einer α-helikalenStruktur begünstigen. In einer noch anderen Ausführungsformwird die Alkylierung unter Bedingungen durchgeführt, diedie Bindung des Vorläufer-Peptidomimetikums an ein anderesProtein derart begünstigen, dass die Bildung der gebundenen α-helikalenKonformation während der Alkylierung induziert wird.
VerschiedeneAusführungsformen von X und Y sind denkbar, die zur Umsetzungmit Thiolgruppen geeignet sind. Allgemein wird jedes X oder Y unabhängigaus der in Tabelle 5 gezeigten allgemeinen Kategorie ausgewählt.Beispielsweise sind X und Y Halogenide, wie beispielsweise -Cl,-Br oder -I. Jeder der hierin beschriebenen makrocyclenbildendenLinker kann in jeglicher Kombination mit jeder der in Tabellen 1–4gezeigten Sequenzen, sowie mit jedem der hierin gezeigten SubstituentenR verwendet werden. TABELLE 7: Beispiele von reaktiven Gruppen,die mit Thiolgruppen reagieren können und die sich darausergebenden Bindungen(1)Xoder Y(2)Sichergebende kovalente Bindung(3)Acrylamid(4)Thioether(5)Halogenid(z. B. Alkyl oder Arylhalogenid)(6)Thioether(7)Sulfonat(8)Thioether(9)Aziridin(10)Thioether(11)Epoxid(12)Thioether(13)Haloacetamid(14)Thioether(15)Malimid(16)Thioether(17)Sulfonatester(18)Thioether
Tabelle8 zeigt beispielhafte erfindungsgemäße Makrocyclen. „NL” steht für Norleucinund ersetzt einen Methioninrest. Es ist denkbar, dass ähnlicheLinker benutzt werden, um peptidomimetische Makrocyclen herzustellen,die von den in Tabelle 1 bis Tabelle 4 offengelegten Polypeptidsequenzenabgeleitet werden. TABELLE8: Beispiele von erfindungsgemäßen peptidomimetischenMakrocyclen In den in dieser Tabelle dargestellten Beispielensteht „NL” fürNorleucin.
Dievorliegende Erfindung sieht die Verwendung von sowohl natürlichvorkommenden als auch nicht-natürlich vorkommenden Aminosäurenund Aminosäurenanaloga zur Herstellung von peptidomimetischenMakrocyclen der Formel (III) vor. Jede Aminosäure oderjedes Aminosäureanalogon, die bzw. das mit den zur Herstellungvon stabilen bissulfhydrylenthaltenden peptidomimetischen Makrocyclenverwendeten Herstellungsverfahren kompatibel ist, kann in der vorliegendenErfindung benutzt werden. Beispielsweise ist Cystein in der vorliegendenErfindung als nützliche Aminosäure vorgesehen.Außer Cystein sind schwefelenthaltende Aminosäurenmit einer anderen Aminosäureseitenkette jedoch ebenfallsnützlich. Beispielsweise enthält Cystein eineMethyleneinheit zwischen dem α-Kohlenstoff der Aminosäureund dem endständigen -SH der Aminosäureseitenkette.Die Erfindung sieht ebenfalls die Verwendung von Aminosäurenmit mehreren Methyleneinheiten zwischen dem α-Kohlenstoffund dem endständigen -SH vor. NichtbeschränkendeBeispiele umfassen α-Methyl-L-homocystein und α-Methyl-D-homocystein.In einigen Ausführungsformen liegen die Aminosäurenund die Aminosäureanaloga in der D-Konfiguration vor. Inanderen Ausführungsformen liegen sie in der L-Konfigurationvor. In einigen Ausführungsformen liegen einige der imPeptidomimetikum enthaltenen Aminosäuren und Aminosäureanalogain der D-Konfiguration vor, während einige der Aminosäurenund Aminosäureanaloga in der L-Konfiguration vorliegen.In einigen Ausführungsformen sind die Aminosäureanaloga α,α-disubstituiert,wie beispielsweise α-Methyl-L-cystein und α-Methyl-D-cystein.
DieErfindung umfasst Makrocyclen, bei denen makrocyclusbildende Linkerbenutzt werden, um zwei oder mehr SH-Einheiten im peptidomimetischenVorläufer unter Bildung der erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen zu verbinden. Wie vorstehend beschriebenvermitteln die makrocyclusbildenden Linker konformative Stabilität,erhöhte metabolische Stabilität und/oder erhöhteZelldurchlässigkeit. Weiterhin stabilisieren die makrocyclusbildendenBindungen in einigen Ausführungsformen die α-helikaleSekundärstruktur der peptidomimetischen Makrocyclen. Diemakrocyclusbildenden Linker besitzen die Formel X-L2-Y,worin, wie vorstehend definiert, sowohl X als auch Y gleiche alsauch verschiedene Einheiten sein können. Sowohl X als auchY weisen chemische Strukturmerkmale auf, die es einem makrocyclusbildendenLinker -L2- ermöglichen, den bissulfhydrylenthaltendenpeptidomimetischen Vorläufer zweimal zu alkylieren. Wievorstehend definiert umfasst der Linker -L2-Alkylen, Alkenylen, Alkinylen, Heteroalkylen, Cycloalkylen, Heterocycloalkylen,Cycloarylen oder Heterocycloarylen oder -R4-K-R4-, welche jeweils wahlweise, wie vorstehenddefiniert, mit einer Gruppe R5 substituiertsein können. Weiterhin ist eines der drei Kohlenstoffatomeinnerhalb der makrocyclusbildenden Linker -L2-,das nicht ein an -SH der sulfhydrylenthaltenden Aminosäuregebundenes Kohlenstoffatom ist, wahlweise mit einem Heteroatom wiebeispielsweise N, S oder O substituiert.
DieL2-Komponente des makrocyclusbildenden LinkersX-L2-Y kann unterschiedliche Längenaufweisen, die unter anderem abhängig von der Entfernungzwischen den Positionen der beiden Aminosäureanaloga, diezur Bildung des makrozyklischen Peptidomimetikums verwendet werden,sind. Beim Variieren der Längen der L1 und/oderL3-Komponenten des makrocyclusbildendenLinkers kann weiterhin auch die Länge von L2 variiertwerden, um somit einen Linker mit einer zur Bildung eines stabilenpeptidiomimetischen Makrocyclus geeigneten Gesamtlängezu erzeugen. Wenn beispielsweise die verwendeten Aminosäureanalogadurch Hinzufügen einer zusätzlichen Methyleneinheitan sowohl L1 als auch L3 variiertwerden, wird die Länge von L2 um eineetwa zwei Methyleneinheiten entsprechende Länge verkürzt,um die größeren Längen von L1 andL3 zu kompensieren.
Ineinigen Ausführungsformen ist L2 eineAlkylengruppe der Formel -(CH2)n-,wobei n eine ganze Zahl zwischen ungefähr 1 und ungefähr15 ist. Beispielsweise ist n 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10.In anderen Ausführungsformen ist L2 eineAlkenylengruppe. In noch anderen Ausführungsformen istL2 eine Arylgruppe.
Tabelle9 zeigte zusätzliche Ausführungsformen von X-L2-Gruppen. TABELLE9. Beispielhafte erfindungsgemäße X-L2-Y-Gruppen. In dieser Tabelle sind X und Y jeweils beispielsweiseunabhängig voneinander Cl-, Br-, oder I-.
ZusätzlicheVerfahren zur Bildung von peptidomimetischen Makrocyclen, von denenes denkbar ist, dass sie zur Ausführung der vorliegendenErfindung geeignet sind, umfassen jene, die in Mustapa,M. Firouz Mohd et al., J. Org. Chem (2003), 68, pp. 8193–8198; Yang,Bin et al. Bioorg Med. Chem. Lett. (2004), 14, pp. 1403–1406; US-Patent 5,364,851; US-Patent 5,446,128; US-Patent 5,824,483; US-Patent 6,713,280 und US-Patent 7,202,332 offengelegtwurden. In solchen Ausführungsformen werden Aminosäurevorläuferbenutzt, die einen zusätzlichen Substituenten R- in derAlpha-Position enthalten. Solche Aminosäuren werden in denMakrocyclusvorläufer an den gewünschten Positioneneingeführt, möglicherweise an den Positionen,wo der Crosslinker substituiert ist oder alternativ irgendwo inder Sequenz des Makrocyclusvorläufers. Zyklisierung wirddann gemäß dem angegebenen Verfahren bewirkt.
AssaysDieEigenschaften der erfindungsgemäßen peptidomimetischenMakrocyclen werden beispielsweise durch die nachfolgend beschriebenenVerfahren geprüft.
Assay zur Bestimmung der α-Helizität.DieSekundärstruktur von Polypeptiden mit α-helikalenDomänen wird in Lösung ein dynamisches Gleichgewichtzwischen Random-Coil-Strukturen und α-helikalen Strukturenerreichen, das häufig in „Prozent Helizität” ausgedrücktwird. Somit sind beispielsweise unmodifizierte pro-apoptotischeBH3-Domänen in Lösung vorwiegend Random Coilsmit einem α-helikalen Anteil von üblicherweiseunter 25%. Im Gegensatz dazu besitzen peptidomimetische Makrocyclenmit optimierten Linker beispielsweise eine Alpha-Helizität,die mindestens doppelt so groß ist, wie die des unvernetztenPolypeptids. In einigen Ausführungsformen werden erfindungsgemäßeMakrocyclen eine Alpha-Helizität größer50% besitzen. Zur Bestimmung der Helizität von erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen, wie beispielsweise auf der BH3-Domäneberuhende Makrocyclen, werden die Verbindungen in wässrigemMedium gelöst (z. B. 50 mM Kaliumphosphat-Lösungbei pH 7 oder in destilliertem H2O, beieiner Konzentration von 25–50 μM). Zirkulardichroismusspektren(CD-Spektren) werden mit einem Polarimeter (z. B. Jasco J-710) unterVerwendung von Standardparametern (z. B. Temperatur, 20°C;Wellenlänge, 190–260 nm; schrittweise Auflösung,0,5 nm; Geschwindigkeit, 20 nm/sec; Akkumulationen, 10; Ansprechvermögen,1 sec; Bandbreite, 1 nm; Weglänge, 0,1 cm). Der α-Helizitätsgehalteines Peptids wird durch Division der Elliptizität bezogenauf die mittlere Anzahl der Aminosäure (z. B.. [Φ]222obs) durch den bekannten Wert eines bekannten helikalen Modelldekapeptids(Yang et al. (1986), Methods Enzymol. 130: 208)berechnet.
Assay zur Bestimmung der Schmelztemperatur(Tm).Einerfindungsgemäßer peptidomimetischer Makrocyclus,der beispielsweise eine durch eine α-Helix hervorgerufeneSekundärstruktur umfasst, weist beispielsweise eine höhereSchmelztemperatur auf als das entsprechende unvernetzte Polypeptid. Üblicherweisebesitzen erfindungsgemäße peptidomimetische Makrocycleneinen Tm 60°C,was eine hochstabile Struktur in wässriger Lösungwiderspiegelt. Zur Bestimmung des Einflusses der Makrocyclusbildungauf die Schmelztemperatur werden peptidomimetische Makrocyclen oderunmodifizierte Peptide in destilliertem H2Ogelöst (z. B. bei einer Endkonzentration von 50 μM),und Tm wird durch Messen der Elliptizitätsänderung übereinen Temperaturbereich (z. B. 4 bis 95°C) mit einem Polarimeter(z. B., Jasco J-710) unter Verwendung von Standardparametern (z.B. Wellelänge 222 nm; schrittweise Auflösung,0,5 nm; Geschwindigkeit, 20 nm/sec; Akkumulationen, 10; Ansprechvermögen,1 sec; Bandbreite, 1 nm; Temperaturerhöhungsgeschwindigkeit:1°C/min; Weglänge, 0,1 cm) bestimmt.
Assay zur Bestimmung der Widerstandsfähigkeitgegenüber Proteasen.DieAmidbindung des Peptidrückgrats ist empfindlich gegenüberHydrolyse durch Proteasen, wodurch peptidische Verbindungen anfälligfür einen schnellen Abbau in vivo werden. Durch Helixbildungdes Peptids jedoch wird üblicherweise das Peptidrückgrateingehüllt, was möglicherweise zu einer Abschirmunggegenüber proteolytischer Spaltung führt. Dieerfindungsgemäßen peptidomimetischen Makrocyclenkönnen einer Proteolyse mit Trypsin in vitro unterzogenwerden, um etwaige Änderungen gegenüber einemunvernetzten Polypeptid in Bezug auf die Abbaugeschwindigkeit festzustellen.Beispielsweise werden der peptidomimetische Makrocyclus und einentsprechendes unvernetztes Polypeptid mit Trypsin/Agarose inkubiert,die Reaktionen durch Zentrifugieren zu verschiedenen Zeitpunktengestoppt und anschließend wird durch HPLC-Injektion dasRestsubstrat durch UV-Absorption bei 280 nm quantitativ bestimmt.Kurzgesagt werden der peptidomimetische Makrocyclus und der peptidomimetischeVorläufer (5 mcg) mit Trypsin/Agarose (Pierce) (S/E ~125)für 0, 10, 20, 90 und 180 Minuten inkubiert. Reaktionenwerden mittels einer Tischzentrifuge bei hoher Umdrehungszahl gestoppt;verbliebenes Substrat im isolierten Überstand wird durchAnalyse eines HPLC-Peaks bei 280 nm quantitativ bestimmt. Die Proteolyseweist eine Reaktionskinetik erster Ordnung auf und die Geschwindigkeitskonstantek wird durch Auftragen einer Kurve von ln[S] über die Zeitbestimmt (k = –1XSteigung).
Ex-vivo-Stabilitätsassay.PeptidomimetischeMakrocyclen mit optimierten Linkem besitzen beispielsweise eineEx-vivo-Halbwertszeit, die mindestens zweimal größerist als jene eines entsprechenden unvernetzten Polypeptids und besitzeneine Ex-vivo-Halbwertszeit von 12 Stunden oder mehr. Zur Ex-vivo-Untersuchungder Stabilität in Serum stehen eine Vielzahl von Assayszur Verfügung. Beispielsweise werden ein peptidomimetischerMakrocyclus und/oder ein entsprechendes unvernetztes Polypeptid(2 mcg) jeweils mit frischem Serum von Maus, Ratte und/oder vomMenschen inkubiert (z. B. 1–2 mL) bei 37°C für0, 1, 2, 4, 8 sowie 24 Stunden. Proben mit verschiedenen Makrocycluskonzentrationenkönnen durch serielle Verdünnung mit Serum hergestelltwerden. Die Bestimmung des Gehalts an intakter Verbindung kann mitdem folgenden Verfahren erfolgen: Extraktion der Proben erfolgtdurch Überführen von 100 μL Serum in2-mL-Zentrifugenröhrchen, gefolgt von Zugabe von 10 μL50%-iger Ameisensäure und 500 μL Acetonitril undzehnminütigem Zentrifugieren bei 14.000 UPM bei 4 ± 2°C.Die Überstände werden dann in frische 2-mL-Röhrchen überführtund am Turbovap unter N2 10 psi bei 37°Czur Trockene eingedampft. Die Proben werden dann in 100 μLAcetonitril:Wasser (50:50) wieder aufgelöst und mittelsLC-MS/MS-Analyse untersucht. Äquvalente oder ähnlicheVerfahren zur Bestimmung der Ex-vivo-Stabilität sind bekanntund können zur Bestimmung der Stabilität von Makrocyclenin Serum verwendet werden.
In-vitro-Bindungsassays.ZurBeurteilung der Bindung und Affinität von peptidomimetischenMakrocyclen and peptidomimetischen Vorläufern mit Akzeptorproteinenwird beispielsweise ein Fluoreszenzpolarisationsassay verwendet.Bei dem FPA-Verfahren wird die molekulare Orientierung und Mobilitätunter Verwendung von polarisiertem Licht und einem fluoreszierendemIndikator gemessen. Bei Anregung mit polarisiertem Licht emittierenfluoreszierende Indikatoren (z. B. FITC), die an Molekülemit hohem scheinbarem Molekulargewicht gekoppelt sind (z. B. anein großes Protein gebundene FITC-markierte Peptide) größereMengen an polarisierter Fluoreszenz aufgrund deren geringeren Rotationsgeschwindigkeitenim Vergleich zu fluoreszierenden Indikatoren, die an kleinere Molekülegekoppelt sind (z. B. sich frei in Lösung befindliche FITC-markiertePeptide).
Beispielsweisewerden fluoresceinierte peptidomimetische Makrocyclen (25 nM) mitdem Akzeptorprotein (25–1000 nM) in Bindungspuffer (140mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4) 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.Die Bindungsaktivität wird beispielsweise durch Fluoreszenzpolarisationauf einem Lumineszenzspektrophotometer gemessen (z. B. Perkin-ElmerLS50B). Kd-Werte können durch nichtlineare Regressionsanalyseunter Verwendung von beispielsweise der Graphpad Prism Software(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) ermittelt werden. Ein erfindungsgemäßerpeptidomimetischer Makrocyclus zeigt in einigen Fällen ähnlicheoder geringere Kd als ein entsprechendes unvernetztes Polypeptid.
Indiesem Assay können beispielsweise Akzeptorproteine fürBH3-Peptide wie beispielsweise BCL-2, BCL-XL,BAX oder MCL1 verwendet werden. Weitere Verfahren zum Durchführensolcher Assays werden nachfolgend im Abschnitt Beispiele beschrieben.
In-vitro-Verdrängungsassay zurCharakterisierung von Antagonisten von Peptid-Protein-Wechselwirkungen.ZurBeurteilung der Bindung und Affinität von Verbindungen,die antagonistisch auf die Wechselwirkung zwischen einem Peptid(z. B. ein BH3-Peptid oder ein p53-Peptid) und einem Akzeptorproteinwirken, wird beispielsweise ein Fluoreszenzpolarisationsassay (FPA)unter Verwendung eines von einer peptidomimetischen Vorläufersequenzabgeleiteten fluoresceinierten peptidomimetischen Makrocyclus verwendet.Bei dem FPA-Verfahren wird die molekulare Orientierung und Mobilitätunter Verwendung von polarisiertem Licht und einem fluoreszierendemIndikator gemessen. Bei Anregung mit polarisiertem Licht emittierenfluoreszierende Indikatoren (z. B. FITC), die an Molekülemit hohem scheinbarem Molekulargewicht gekoppelt sind (z. B. an eingroßes Protein gebundene FITC-markierte Peptide) größereMengen an polarisierter Fluoreszenz aufgrund deren geringeren Rotationsgeschwindigkeitenim Vergleich zu fluoreszierenden Indikatoren, die an kleinere Molekülegekoppelt sind (z. B. sich frei in Lösung befindliche FITC-markiertePeptide. Eine Verbindung, die antagonistisch auf die Wechselwirkungzwischen dem fluoresceinierten peptidomimetischen Makrocyclus undeinem Akzeptorprotein wirkt, wird in einem kompetitiven Bindungs-FPA-Experimentnachgewiesen.
Beispielsweisewerden Verbindungen, von denen vermutet wird, dass sie antagonistischwirken (1 nM bis 1 mM) und ein fluoresceinierter peptidomimetischerMakrocyclus (25 nM) mit dem Akzeptorprotein (50 nM) in Bindungspuffer(140 mM NaCl, 50 mM Tris-HCL, pH 7,4) 30 Minuten bei Raumtemperaturinkubiert. Die antagonistische Bindungsaktivität wird beispielsweisedurch Fluoreszenzpolarisation auf einem Lumineszenzspektrophotometergemessen (z. B. Perkin-Elmer LS50B). Kd-Werte können durchnichtlineare Regressionsanalyse unter Verwendung von beispielsweiseder Graphpad Prism Software (GraphPad Software, Inc., San Diego,CA) ermittelt werden.
Indiesem Assay können sämtliche Molekülklassen,wie beispielsweise kleine organische Moleküle, Peptide,Oligonucleotide oder Proteine als vermeintliche Antagonisten untersuchtwerden. Akzeptorproteine für BH3-Peptide wie beispielsweiseBCL2, BCL-XL, BAX oder MCL1 können in diesem Assay verwendetwerden. Weitere Verfahren zum Durchführen solcher Assayswerden nachfolgend im Abschnitt Beispiele beschrieben.
Bindungsassays in Zelllysaten oder inintakten Zellen.DieBindung von Peptiden oder peptidomimetischen Makrocyclen an ihrenatürlichen Akzeptoren kann in Zelllysaten oder in intaktenZellen durch Immunpräzipitation und Pull-down-Experimentebestimmt werden. Beispielsweise werden intakte Zellen mit fluoresceinierten(FITC-markiert) oder biotinylierten Verbindungen 4 h ohne Seruminkubiert, gefolgt vom Zusetzen von Serum und weiterer Inkubationfür 4–18 h. Alternativ können Zellenfür die Dauer des Experiments in Opti-MEM (Invitrogen)inkubiert werden. Die Zellen werden dann pelletiert und in Lysepuffer(50 mM Tris [pH 7,6], 150 mM NaCl, 1% CHAPS und Proteaseinhibitor-Cocktail)10 Minuten bei 4°C inkubiert. 1% NP-40 oder Triton X-100kann anstelle von CHAPS verwendet werden. Extrakte werden 15 Minutenbei 14.000 UPM zentrifugiert und Überstände werdengewonnen und mit 10 μL anti-FITC-Antikörper vonder Ziege oder streptavidinbeschichteten Kügelchen 2 hrotierend bei 4°C inkubiert, gefolgt von weiteren 2 h Inkubationbei 4°C mit Protein A/G Sepharose (50 μL einer50%-igen Suspension der Kügelchen). Bei Verwendung vonStreptavidinkügelchen zum Pull-Down von biotinyliertenVerbindungen ist kein Sekundärschritt erforderlich. Alternativwerden FITC-markierte oder biotinylierte Verbindungen mit wie vorstehendbeschrieben hergestellten Zelllysaten 2 h rotierend bei 4°Cinkubiert, gefolgt von Inkubation mit 10 μL anti-FITC-Antikörpervon der Ziege oder streptavidinbeschichteten Kügelchen2 h rotierend bei 4°C, gefolgt von weiteren 2 h Inkubationbei 4°C mit Protein A/G Sepharose (50 μL einer50%-igen Suspension der Kügelchen). Bei Verwendung vonStreptavidinkügelchen zum Pull-Down von biotinyliertenVerbindungen ist kein Sekundärschritt erforderlich. Nachkurzer Zentrifugation können die Pellets in Lysepuffermit steigender Salzkonzentration (z. B. 150, 300, 500 mM NaCl) gewaschenwerden. Die Kügelchen können dann in 150 mM NaCl erneut äquilibriertwerden, bevor SDS-enthaltender Probenpuffer zugesetzt und zum Siedenerhitzt wird. Die Kügelchen und Zelllysate könnenelektrophoretisch unter Verwendung von Bis-Tris-Gelen mit einem4%–12% Gradienten aufgetrennt werden und anschließendauf Immobilon-P-Membranen übertragen werden. Nach Blockierungkönnen Blots mit einem Antikörper, der FITC bzw.Biotin nachweist, sowie ebenfalls mit einem oder mehr Antikörpern,die Proteine detektieren, die an den peptidomimetischen Makrocyclusbinden, einschließlich BCL2, MCL1, BCL-XL, A1, BAX undBAK, inkubiert werden. Die Beladung der Blots der Lysate kann fernermit anti-Hsc-70 bestimmt werden. Alternativ kann das Gel nach Elektrophoresemit Silber gefärbt werden, um Proteine nachzuweisen, diespezifisch mit FITC-markierten oder biotinylierten Verbindungenerniedrigt werden.
Zelluläre Penetrationsassays.Einpeptidomimetischer Makrocyclus ist beispielsweise zellgängigerim Vergleich zu einem entsprechenden unvernetzten Polypeptid. Ineinigen Ausführungsformen sind die peptidomimetischen Makrocyclen zellgängigerals ein entsprechendes unvernetztes Polypeptid. PeptidomimetischeMakrocyclen mit optimierten Linker besitzen beispielsweise Zellpenetration,die mindestens zweimal größer ist als die einesentsprechenden unvernetzten Polypeptids und häufig wirdbeobachtet, dass nach 4 Stunden 20% oder mehr des eingesetzten peptidomimetischenMakrocyclus die Zelle penetriert haben. Zur Messung der Zellpenetrationvon peptidomimetischen Makrocyclen und entsprechenden unvernetztenPolypeptiden werden intakte Zellen mit fluoresceinierten peptidomimetischenMakrocyclen oder entsprechenden unvernetzten Polypeptiden (10 μM)4 h in serumfreiem Medium bei 37°C inkubiert, zweimal mitMedium gewaschen und mit Trypsin (0,25%) 10 min bei 37°Cinkubiert. Die Zellen werden noch einmal gewaschen und in PBS resuspendiert.Zelluläre Fluoreszenz wird beispielsweise unter Verwendungentweder eines FACSCalibur Durchflusszytometers oder einem CellomicsKineticScan® HCS Reader bestimmt.Andere Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Zellpenetrationkönnen verwendet werden. Ein spezielles Verfahren wirdausfühlich in den bereitgestellten Beispielen beschrieben.
Zelluläre Wirksamkeitsassays.DieWirksamkeit von bestimmten peptidomimetischen Makrocyclen wird beispielsweisein zellbasierten Killassays unter Verwendung einer Vielzahl vontumorgenen und nicht-tumorgenen Zelllinien und primären Zellen,die von von menschlichen oder von der Maus stammenden Zellpopulationengewonnen wurden, bestimmt. Die Lebensfähigkeit der Zellenwird beispielsweise während 24–96 h Inkubationmit peptidomimetischen Makrocyclen (0,5 to 50 μM) beobachtet,um jene zu identifizieren, die mit einer EC50 10 μMabtöten. In diesem Zusammenhang bezieht sich EC50 auf die halbmaximale effektive Konzentration,welche die Konzentration des peptidomimetischen Makrocyclus repräsentiert,bei der 50% der Population lebensfähig ist. VerschiedeneStandardassays zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von Zellensind im Handel erhältlich und werden wahlweise zur Beurteilungder Wirksamkeit der peptidomimetischen Makrocyclen verwendet. Darüberhinaus werden Assays, die Annexin V und Caspase-Aktivierung messen,wahlweise benutzt, um zu beurteilen, ob die peptidomimetischen MakrocyclenZellen durch Aktivierung der Apoptosemaschinerie abtöten.Beispielsweise wird der Cell Titer-glo-Assay eingesetzt, der dieLebensfähigkeit der Zellen in Abhängigkeit derintrazellulären ATP-Konzentration ermittelt.
In-vivo-Stabilitatsassay.ZurUntersuchung der In-vivo-Stabilität der peptidomimetischenMakrocyclen werden die Verbindungen beispielsweise Mäusenund/oder Ratten IV, IP, SC, PO oder durch Inhalation in Konzentrationenim Bereich von 0,1 bis 50 mg/kg verabreicht, und es werden Blutproben0 min, 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h und 48 hnach der Injektion entnommen. Die Menge an intakter Verbindung in25 μL frischem Serum wird dann durch LC-MS/MS wie hierinbeschrieben bestimmt.
In-vivo-Wirksamkeit in Tiermodellen.ZurBestimmung der anti-onkogenen Aktivität von erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen in vivo werden die Verbindungen beispielsweiseallein (IP, IV, SC, PO, durch Inhalation oder auf nasalem Wege)oder in Kombination mit suboptimalen Dosen entsprechender Chemotherapeutika(z. B. Cyclophosphamid, Doxorubicin, Etoposid) verabreicht. In einemBeispiel werden 5 × 106 SEMK2-Zellen(gewonnen aus dem Knochenmark eines Patienten mit akuter lymphatischerLeukämie), die stabil Luziferase exprimieren, überdie Schwanzvene in NOD-SCID, SCID-beige oder NOD.IL2rg KO-Mäuse3 h nachdem sie einer Gesamtkörperbestrahlung ausgesetztwurden, injiziert. Nichtbestrahlte Mäuse werden in diesenStudien ebenfalls benutzt. Unbehandelt führt diese Formvon Leukämie in diesem Modell in 3 Wochen zum Tode. DieLeukämie wird in einfacher Weise überwacht, beispielsweise,durch Injizieren der Mäuse mit D-Luciferin (60 mg/kg) undImaging der narkotisierten Tiere (z. B. Xenogen In Vivo ImagingSystem, Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Die Gesamtkörperbiolumineszenzwird durch Integration des Photonenflusses (photons/sec) durch LivingImage Software (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) quantitativbestimmt. Peptidomimetische Makrocyclen allein oder in Kombinationmit suboptimalen Dosen entsprechender Chemotherpeutika werden beispielsweiseleukämischen Mäusen über die Schwanzveneoder IP in Dosen im Bereich von from 0,1 mg/kg bis 50 mg/kg für7 bis 21 Tage verabreicht (8–10 Tage nach Injektion/Tag1 des Experiments im Biolumineszenzbereich 14–16). Wahlweisewerden die Mäuse während des gesamten Experimentsjeden zweiten Tag dargestellt und Überleben täglich überdie Dauer des Experiments beobachtet. An toten Mäusen kannwahlweise am Ende des Experiments eine Nekropsie durchgeführtwerden. Ein weiteres Tiermodell ist die Implantation von DoHH2,einer vom menschlichen follikulärem Lymphom abgeleitetenZelllinie, die stabil Luciferase exprimiert, in NOD-SCID-Mäuse.Diese In-vivo-Tests erzeugen wahlweise vorläufige Pharmakokinetik-,Pharmakodynamik und Toxikologiedaten.
Klinische Studien.ZurBestimmung der Eignung der erfindungsgemäßen peptidomimetischenMakrocyclen in der Behandlung von Menschen werden klinische Studiendurchgeführt. Beispielsweise werden Patienten mit einer Krebsdiagnose,die einer Behandlung bedürfen, ausgewählt undin Behandlungsgruppe und eine oder mehrere Kontrollgruppen eingeteilt,wobei der Behandlungsgruppe ein erfindungsgemäßerpeptidomimetischer Makrocyclus verabreicht wird, währenddie Kontrollgruppe ein Plazebo, ein bekanntes Antikrebsmittel oderden Behandlungsstandard erhält. Die Verträglichkeitund Wirksamkeit der erfindungsgemäßen peptidomimetischenMakrocyclen kann somit dadurch festgestellt werden, in dem Patientengruppenbezüglich. Faktoren wie beispielsweise Überlebenund Lebensqualität verglichen werden. In diesem Beispielzeigt. die Patientengruppe, die mit einem peptidomimetischen Makrocyclusbehandelt wurde, verbessertes Langzeitüberleben im Vergleichzu einer Patientenkontrollgruppe, die mit Plazebo oder dem Behandlungsstandardbehandelt wurde.
Pharmazeutische Zusammensetzungen undVerabreichungswegeVerabreichungsverfahrenumfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, intradermal,intramuskulär, intraperitoneal, intravenös, subkutan,intranasal, epidural, oral, sublingual, intrazerebral, intravaginal,transdermal, rektal, durch Inhalation oderr topisch durch Anwendungan Ohren, Nase, Augen oder Haut.
Dieerfindungsgemäßen peptidomimetischen Makrocyclenumfassen ebenfalls pharmazeutisch annehmbare Derivate oder Prodrugsderselben. Ein „pharmarmazeutisch annehmbares Derivat” bedeutetjedes pharmazeutisch annehmbare Salz, Ester, Salz eines Esters,Prodrug oder anderes Derivat einer erfindungsgemäßenVerbindung, welche nach Verabreichung an einen Empfängerin der Lage ist (direkt oder indirekt), eine erfindungsgemäßeVerbindung bereitzustellen. Beispielsweise können pharmazeutischannehmbare Derivate möglicherweise die Bioverfügbarkeitder erfindungsgemäßen Verbindungen erhöhen,wenn sie einem Säuger verabreicht werden (z. B. durch Erhöhender Absorption ins Blut einer oral verabreichten Verbindung) odersie erhöhen die Abgabe des Wirkungsstoffs an ein biologischesKompartiment (z. B. das Gehirn oder das lymphatische System) imVergleich zur Ausgangsverbindung. Einige pharmazeutisch annehmbarenDerivate umfassen eine chemische Gruppe, die die Wasserlöslichkeitoder den aktiven Transport durch die Magen-Darm-Schleimhaut verbessert.
Ineinigen Ausführungsformen werden die erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen durch kovalentes oder nichtkovalentesAnbringen geeigneter funktioneller Gruppen modifiziert, um bestimmte biologischeEigenschaften zu verstärken. Derartige Modifikationen umfasssensolche, die die biologische Penetrierung in ein vorgegebenes biologischesKompartiment erhöhen (z. B. Blut, lymphatisches System,Zentralnervensystem), die die orale Verfügbarkeit erhöhen,die die Löslichkeit erhöhen, um Verabreichungdurch Injektion zu ermöglichen, die den Metabolismus ändernund die die Ausscheidungsrate beeinflussen.
Pharmazeutischannehmbare Salze der erfindungsgemäßen Verbindungenumfassen solche, die von pharmazeutisch annehmbaren inorganischenund organischen Säuren und Basen abgeleitet werden. Beispielevon geeigneten Salzen von Säuren umfassen Acetat, Adipat,Benzoat, Benzolesulfonat, Butyrat, Citrat, Digluconat, Dodecylsulfat,Format, Fumarat, Glycolat, Hemisulfat, Heptanoat, Hexanoat, Hydrochlorid,Hydrobromid, Hydroiodid, Lactat, Maleat, Malonat, Methansulfonat,2-Naphthalinsulfonat, Nicotinat, Nitrat, Palmoat, Phosphat, Pikrat,Pivalat, Propionat, Salicylat, Succinat, Sulfat, Tartrat, Tosylatund Undecanoat. Salze, die von geeigneten Basen abgeleitet sind,umfassen Alkalimetall-(z. B. Natrium), Erdalkalimetall-(z. B. Magnesium), Ammonium-und N-(Alkyl)4+-Salze.
Pharmazeutischannehmbare Träger zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungender erfindungsgemäßen Verbindingungen umfassensowohl feste als auch flüssige Träger. Feste Präparateumfassen Pulver, Tabletten, Pillen, Kapseln, Cachets, Zäpfchensowie dispersierbare Granulate. Ein fester Träger kannein oder mehrere Substanzen sein, der ebenfalls als Verdünnungsmittel,Aromastoff, Bindemittel, Konservierungsstoff, Tablettensprengmitteloder als ein Verkapselungsmaterial wirkt. Details überTechniken zur Formulierung und Verabreichung sind ausführlichin der wissenschaftlichen und in der Patentliteratur beschrieben,siehe beispielsweise die neueste Ausgabe von Remington\'s PharmaceuticalSciences, Maack Publishing Co, Esston PA.
InPulvern ist der Träger ein feinverteilter Feststoff, welcherals Gemisch mit dem feinverteilten Wirkstoff vorliegt. In Tablettenist der Wirkstoff mit dem Träger, der die notwendigen Bindungseigenschaftenaufweist, in geeigneten Verhältnissen vermischt und inder gewünschten Form und Größe zusammengepresst.
Geeignetefeste Hilfsstoffe umfassen Kohlenhydrate oder Proteinfüllstoffeeinschließlich, aber nicht beschränkt auf Zucker,einschließlich Dextrose, Lactose, Saccharose, Mannitoloder Sorbitol; Stärke aus Mais, Weizen, Reis, Kartoffeloder aus anderen Pflanzen; Cellulose wie beispielsweise Methylcellulose,Hydroxypropylmethylcellulose oder Natriumcarboxymethylcellulose;sowie Gummi einschließlich Gummi arabicum und Tragant;sowie Proteine, wie beispielsweise Gelatine und Collagen. Fallsgewünscht werden Sprengmittel oder Lösevermittlerzugesetzt, wie beispielsweise vernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar,Alginsäure oder deren Salze, wie beispielsweise Natriumalginat.
Zubereitungenin flüssiger Form umfassen Lösungen, Suspensionensowie Emulsionen wie beispielsweise Wasser oder Wasser/Propylenglycollösungen.Für parenterale Injektion können flüssigeZubereitungen in wässriger Polyethylenglycollösungformuliert werden. Der Begriff „parenteral”, wieer hierin verwendet wird, bezieht sich auf Verabreichungsmethoden,einschließlich intravenös, intraarteriell, intramuskulär,intraperitoneal, intrasternal sowie subkutan.
Diepharmazeutische Zubereitung ist vorzugsweise in Dosierungseinheitsform.In dieser Form ist die Zubereitung in Dosiseinheiten mit entsprechendenMengen des Wirkstoffs unterteilt. Die Dosiseinheit kann eine verpackteZubereitung sein, wobei die Verpackung einzelne Mengeneinheitender Zubereitung enthält, wie beispielsweise verpackte Tabletten,Kapseln sowie Pulver in Fläschchen oder Ampullen. Außerdem kann dieDosierungseinheitsform selbst eine Kapsel, Tablette, Cachet oderLutschtablette sein oder eine entsprechende Anzahl an jeder dieserin verpackter Form sein.
Wenndie erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eine Kombinationaus einem peptidomimetischen Makrocyclus und einem oder mehrerenzusätzlichen therapeutischen oder prophylaktischen Mittelnumfassen, sollten sowohl die Verbindung als auch das zusätzlichenMittel in Dosen zwischen etwa 1 bis 100% vorhanden sein und mehrbevorzugt zwischen etwa 5 bis 95% der Dosis, die in der Regel ineinem Monotherapiebehandlungsschema verabreicht wird. In einigenAusführungsformen werden die zusätzlichen Mittelseparat von den erfindungsgemäßen Verbindungenals Teil eines Mehrfachdosenbehandlungsschemas verabreicht. Alternativsind diese Mittel Teil einer einzigen Darreichungsform, zusammengemischtmit den erfindungsgemäßen Verbindungen in einereinzigen Zusammensetzung.
AnwendungenIneinem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung neuartige peptidomimetischeMakrocyclen bereit, die nützlich in kompetitiven Bindungsassayssind, um Mittel zu identifizieren, die an den (die) natürlichenLigand(en) der Proteine oder Peptide binden, nach denen die peptidomimetischenMakrocyclen entworfen worden sind. Beispielsweise könnenim BH3/BCL-XL anti-apoptotischen Systemmarkierte peptidomimetische Makrocyclen, die auf BH3 beruhen, ineinem BCL-XL Bindungsassays zusammen mitkleinen Molekülen, die kompetitiv BCL-XL binden,verwendet werden. Kompetitive Bindungsstudien ermöglicheneine rasche In-vitro-Bewertung und Ermittlung von Wirkstoffkandidaten,die spezifisch für das BH3/BCL-XL-Systemsind. Die Erfindung sieht weiterhin die Erzeugung von Antikörperngegen die peptidomimetischen Makrocyclen vor. In einigen Ausführungsformenbinden diese Antikörper spezifisch sowohl den peptidomimetischenMakrocyclus als auch die peptidomimetischen BH3-Vorläufer,von denen die peptidomimetischen Makrocyclen abgeleitet werden.Solche Antikörper fuhren beispielsweise zu einer Störungder BH3/BCL-XL-Systeme.
Inanderen Aspekten stellt die vorliegende Erfindung prophylaktischeund therapeutische Methoden zur Behandlung eines Patienten bereit,bei dem die Gefahr einer (oder eine Anfälligkeit füreine) Störung oder das Vorhandensein einer Störung,die im Zusammenhang mit aberranter (z. B. unzureichender oder übermäßiger)Expression oder Aktivität (z. B. Anomalien des extrinsischenoder intrinsischen Apoptosewegs) von Mitgliedern der BCL-2-Familiesteht, besteht. Es wird vermutet, dass einige Störungenvom BCL-2-Typ zumindest teilweise durch einen ungewöhnlichenPegel eines oder mehrerer Mitglieder der BCL-2-Familie (z. B. Über- oderUnterexpression) oder durch die Anwesenheit eines oder mehrererMitglieder der BCL-2-Familie, die eine anormale Aktivitätaufweisen, verursacht werden. Als solches nutzt man die Absenkungdes Pegels und/oder der Aktivität des Mitglieds der BCL-2Familie oder die Erhöhung des Pegels und/oder der Aktivitätdes Mitglieds der BCL-2 Familie beispielsweise zur Verbesserungoder Verringerung der negativen Auswirkung der Störung.
Ineiner Ausführungsform werden die erfindungsgemäßenVerbindungen verwendet, um Störungen im Zusammenhang mitExpression oder Überexpression von Mcl-1 zu behandeln.Es wurde gezeigt, dass Mcl-1 in vielen Geweben und neoplastischenZelllinien exprimiert wird und vermutlich an der Entwicklung vonbösartigen Tumoren beteiligt ist (Thallinger etal. (2004) Clin. Cancer Res. 10: 4185–4191). Die erfindungsgemäßen peptidomimetischenMakrocyclen können zur Behandlung solcher bösartigenTumoren eingesetzt werden.
Ineiner Ausführungsform spricht die behandelte Störung(z. B. Krebs) unterschiedlich auf die erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen an. In einigen Ausführungsformenwird der Krebs mit einem BIM peptidomimetischen Makrocyclus behandeltund ist gemäß einem In-vitro-Assay zur Bestimmungder Lebensfähigkeit von Zellen mindestens zweimal wenigerempfindlich gegenüber der Behandlung mit einem BID Polypeptid(wie ein BID peptidomimetischer Makrocyclus oder ein unvernetztesPolypeptid). In anderen Ausführungsformen ist der Krebsgemäß einem In-vitro-Assay zur Bestimmung derLebensfähigkeit von Zellen mindestens fünfmalweniger empfindlich gegenüber der Behandlung mit einemBID Polypeptid. In wieder anderen Ausführungsformen istder Krebs gemäß einem In-vitro-Assay zur Bestimmungder Lebensfähigkeit von Zellen mindestens achtmal wenigerempfindlich gegenüber der Behandlung mit einem BID Polypeptid.In anderen Ausführungsformen wird der Krebs mit einem BIDpeptidomimetischen Makrocyclus behandelt und ist gemäß einemIn-vitro-Assay zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von Zellenmindestens zweimal weniger empfindlich gegenüber der Behandlungmit einem BIM Polypeptid (z. B. ein BIM peptidomimetischer Makrocyclusoder ein unvernetztes Polypeptid). In anderen Ausführungsformenist der Krebs gemäß einem In-vitro-Assay zur Bestimmungder Lebensfähigkeit von Zellen mindestens fünfmalweniger empfindlich gegenüber der Behandlung mit einemBIM Polypeptid. In wieder anderen Ausführungsformen istder Krebs gemäß einem In-vitro-Assay zur Bestimmungder Lebensfähigkeit von Zellen mindestens achtmal wenigerempfindlich gegenüber der Behandlung mit einem BIM Polypeptid
Ineiner weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Behandlungeines menschlichen Patienten bereitgestellt, umfassend Durchführeneines Assays zur Untersuchung der Pegel eines Proteins der BCL-Familieund Verabreichen dem Patienten einen peptidomimetischen Makrocyclus,wenn ein abberantes oder unregelmäßiges Maß anExpression des Proteins der BCL-Familie nachgewiesen wird. Zur BCL-Familiegehören Proteine wie beispielsweise BCL-2, Bcl-XL, MCL-1,Bfl1/A1, BOO/DIVA, NRH/NR13, BAX, BAD, BAK, BOK, BIK, PUMA, BIM,BMF, BLK, BNIP3, HRK, NIX, SPIKE und Noxa. In einer Ausführungsformwird ein Verfahren zur Behandlung eines menschlichen Patienten bereitgestellt,umfassend Durchführen eines Assays zur Untersuchung derPegel von BCL-2 in dem Patient und Verabreichen dem Patienten einenpeptidomimetischen Makrocyclus, wenn ein abberantes oder unregelmäßigesMaß an BCL-2-Expression nachgewiesen wird. In einer weiterenAusführungsform wird ein Verfahren zur Behandlung einesmenschlichen Patienten bereitgestellt, umfassend Durchführeneines Assays zur Untersuchung der Pegel von BCL-XL in dem Patientund Verabreichen dem Patienten einen peptidomimetischen Makrocyclus,wenn ein abberantes oder unregelmäßiges Maß anBCL-XL-Expression nachgewiesen wird. In einer weiteren Ausführungsformwird ein Verfahren zur Behandlung eines menschlichen Patienten bereitgestellt,umfassend Durchführen eines Assays zur Untersuchung der Pegelvon MCL-1 in dem Patient und Verabreichen dem Patienten einen peptidomimetischenMakrocyclus, wenn ein abberantes oder unregelmäßigesMaß an MCL-1-Expression nachgewiesen wird. In einer weiteren Ausführungsformwird ein Verfahren zur Behandlung eines menschlichen Patienten bereitgestellt,umfassend Durchführen eines Assays zur Untersuchung derPegel von BAX in dem Patient und Verabreichen dem Patienten einenpeptidomimetischen Makrocyclus, wenn ein abberantes oder unregelmäßigesMaß an BAX-Expression nachgewiesen wird. In einer weiterenAusführungsform wird ein Verfahren zur Behandlung eines menschlichenPatienten bereitgestellt, umfassend Durchführen eines Assayszur Untersuchung der Pegel von BAD in dem Patient und Verabreichendem Patienten einen peptidomimetischen Makrocyclus, wenn ein abberantesoder unregelmäßiges Maß an BAD-Expressionnachgewiesen wird. In einer weiteren Ausführungsform wirdein Verfahren zur Behandlung eines menschlichen Patienten bereitgestellt,umfassend Durchführen eines Assays zur Untersuchung derPegel von BAK in dem Patient und Verabreichen dem Patienten einenpeptidomimetischen Makrocyclus, wenn ein abberantes oder unregelmäßigesMaß an BAK-Expression nachgewiesen wird. In einer weiterenAusführungsform wird ein Verfahren zur Behandlung einesmenschlichen Patienten bereitgestellt, umfassend Durchführeneines Assays zur Untersuchung der Pegel von PUMA in dem Patientund Verabreichen dem Patienten einen peptidomimetischen Makrocyclus,wenn ein abberantes oder unregelmäßiges Maß anPUMA-Expression nachgewiesen wird. In einer weiteren Ausführungsformwird ein Verfahren zur Behandlung eines menschlichen Patienten bereitgestellt,umfassend Durchführen eines Assays zur Untersuchung derPegel von Noxa in dem Patient und Verabreichen dem Patienten einenpeptidomimetischen Makrocyclus, wenn ein abberantes oder unregelmäßigesMaß an Noxa-Expression nachgewiesen wird. In einer weiterenAusführungsform wird ein Verfahren zur Behandlung einesmenschlichen Patienten bereitgestellt, umfassend Durchführeneines Assays zur Untersuchung der Pegel von Noxa in dem Patientund Verabreichen dem Patienten einen peptidomimetischen Makrocyclus,wenn ein abberantes oder unregelmäßiges Maß an Noxa-Expressionnachgewiesen wird. In einer weiteren Ausführungsform wirdein Verfahren zur Behandlung eines menschlichen Patienten bereitgestellt,umfassend Durchführen eines Assays zur Untersuchung derPegel von Bfl-1/A1 in dem Patient und Verabreichen dem Patienteneinen peptidomimetischen Makrocyclus, wenn ein abberantes oder unregelmäßigesMaß an Bfl1/A1-Expression nachgewiesen wird. In einer weiteren Ausführungsformwird ein Verfahren zur Behandlung eines menschlichen Patienten bereitgestellt,umfassend Durchführen eines Assays zur Untersuchung derPegel von BOO/DIVA in dem Patient und Verabreichen dem Patienteneinen peptidomimetischen Makrocyclus, wenn ein abberantes oder unregelmäßigesMaß an BOO/DIVA-Expression nachgewiesen wird. In einerweiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Behandlungeines menschlichen Patienten bereitgestellt, umfassend Durchführeneines Assays zur Untersuchung der Pegel von NRH/NR13 in dem Patientund Verabreichen dem Patienten einen peptidomimetischen Makrocyclus,wenn ein abberantes oder unregelmäßiges Maß anNRH/NR13-Expression nachgewiesen wird. In einer weiteren Ausführungsformwird ein Verfahren zur Behandlung eines menschlichen Patienten bereitgestellt, umfassendDurchführen eines Assays zur Untersuchung der Pegel vonBOK in dem Patient und Verabreichen dem Patienten einen peptidomimetischenMakrocyclus, wenn ein abberantes oder unregelmäßigesMaß an BOK-Expression nachgewiesen wird. In einer weiterenAusführungsform wird ein Verfahren zur Behandlung einesmenschlichen Patienten bereitgestellt, umfassend Durchführeneines Assays zur Untersuchung der Pegel von BIK in dem Patient undVerabreichen dem Patienten einen peptidomimetischen Makrocyclus,wenn ein abberantes oder unregelmäßiges Maß anBIK-Expression nachgewiesen wird. In einer weiteren Ausführungsformwird ein Verfahren zur Behandlung eines menschlichen Patienten bereitgestellt,umfassend Durchführen eines Assays zur Untersuchung derPegel von BMF in dem Patient und Verabreichen dem Patienten einen peptidomimetischenMakrocyclus, wenn ein abberantes oder unregelmäßigesMaß an BMF-Expression nachgewiesen wird. In einer weiterenAusführungsform wird ein Verfahren zur Behandlung einesmenschlichen Patienten bereitgestellt, umfassend Durchführeneines Assays zur Untersuchung der Pegel von BLK in dem Patient undVerabreichen dem Patienten einen peptidomimetischen Makrocyclus,wenn ein abberantes oder unregelmäßiges Maß anBLK-Expression nachgewiesen wird. In einer weiteren Ausführungsformwird ein Verfahren zur Behandlung eines menschlichen Patienten bereitgestellt,umfassend Durchführen eines Assays zur Untersuchung derPegel von BNIP3 in dem Patient und Verabreichen dem Patienten einenpeptidomimetischen Makrocyclus, wenn ein abberantes oder unregelmäßigesMaß an BNIP3-Expression nachgewiesen wird. In einer weiterenAusführungsform wird ein Verfahren zur Behandlung einesmenschlichen Patienten bereitgestellt, umfassend Durchführeneines Assays zur Untersuchung der Pegel von HRK in dem Patient und Verabreichendem Patienten einen peptidomimetischen Makrocyclus, wenn ein abberantesoder unregelmäßiges Maß an HRK-Expressionnachgewiesen wird. In einer weiteren Ausführungsform wirdein Verfahren zur Behandlung eines menschlichen Patienten bereitgestellt,umfassend Durchführen eines Assays zur Untersuchung derPegel von Nix in dem Patient und Verabreichen dem Patienten einenpeptidomimetischen Makrocyclus, wenn ein abberantes oder unregelmäßigesMaß an Nix-Expression nachgewiesen wird. In einer weiteren Ausführungsformwird ein Verfahren zur Behandlung eines menschlichen Patienten bereitgestellt,umfassend Durchführen eines Assays zur Untersuchung derPegel von SPIKE in dem Patient und Verabreichen dem Patienten einenpeptidomimetischen Makrocyclus, wenn ein abberantes oder unregelmäßigesMaß an SPIKE-Expression nachgewiesen wird.
Wiehierin verwendet, versteht man unter dem Begriff „Behandlung” dieAnwendung oder die Verabreichung eines therapeutischen Mittels einemPatienten, oder die Anwendung oder die Verabreichung eines therapeutischenMittels einem isolierten Gewebe oder Zelllinie eines Patienten,der eine Krankheit, ein Symptom einer Krankheit oder eine Veranlagungzu einer Krankheit hat, mit dem Zweck, die Krankheit, die Symptomeeiner Krankheit oder die Veranlagung zu einer Krankheit auszukurieren,zu heilen, zu verringern, zu lindem, zu verändern, zu beheben,zu bessern, zu verbessern oder zu beeinflussen.
Ineinigen Ausführungsformen werden die erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen verwendet, um Krebserkrankungen undneoplastische Bedingungen zu behandeln, diesen vorzubeugen und/oder diesezu diagnostizieren. Wie hierin verwendet beziehen sich die Begriffe „Krebs”, „hyperproliferativ” und „neoplastisch” aufZellen mit der Fähigkeit zu autonomem Wachstum, d. h. aufein durch schnell proliferierendes Zellwachstum gekennzeichnetesabnormes Stadium oder Zustand. Hyperproliferative und neoplastische Krankheitszuständekönnen als pathologisch klassifiziert werden, was sovielbedeutet wie einen Krankheitszustand charakterisieren oder darstellen.Sie können auch als nicht pathologisch klassifiziert werden,was soviel bedeutet wie, dass zwar eine Abweichung vom Normalzustandvorliegt, der aber nicht mit einem Krankheitszustand in Zusammenhangsteht. Der Begriff soll alle Arten krebsartiger Gewächseoder onkogener Prozesse, metastatischer Gewebe oder maligner transformierterZellen, Gewebe oder Organe umfassen, unbeschadet des etwaigen histopathologischenTyps oder Stadiums der Eindringungsfähigkeit. Eine metastasischerTumor kann aus einer Vielzahl von Primärtumorarten hervorgehen,einschließlich aber nicht beschränkt auf jene,die ihren Ursprung in Brust, Lunge, Leber, Darm oder Eierstock haben. „Pathologischehyperproliferative” Zellen treten in Krankheitszuständenauf, die durch Wachstum bösartiger Tumoren gekennzeichnetsind. Beispiele für nicht-pathologische hyperproliferativeZellen umfassen die Proliferation von Zellen im Zusammenhang mit derWundheilung. Beispiele für zelluläre proliferativeund/oder differentiative (see 0066) Erkrankungen umfassen Krebs,z. B. Karzinom, Sarkom oder metastatische Störungen. ineinigen Ausführungsformen sind die peptidomimetischen Makrocyclenneuartige therapeutische Mittel zur Bekämpfung von Brustkrebs,Eierstockkrebs, Darmkrebs, Lungenkrebs, Metastasen solcher Krebsartenund dergleichen.
Beispielefür Krebserkrankungen oder neoplastischen Bedingungen umfassen,sind aber nicht beschränkt auf, ein Fibrosarkom, Myosarkom,Liposarkom, Chondrosarkom, Osteosarkom, Chordom, Angiosarkom, Endothelsarkom,Lymphangiosarkom, Lymphangioendothelsarkom, Synovialom, Mesotheliom,Ewing-Tumor, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Magenkrebs, Speiseröhrenkrebs,Darmkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs,Gebärmutterkrebs, Kopf-Hals-Krebs, Hautkrebs, Gehirntumor,Plattenepithelkarzinom, Talgdrüsenkarzinom, papilläresKarzinom, papilläres Adenokarzinom, Zystadenokarzinom,medulläres Karzinom, Bronchialkarzinom, Nierenzellkarzinom,Hepatom, Gallengangskarzinom, Chorionkarzinom, Seminom, embryonalesKarzinom, Wilms-Tumor, Gebärmutterhalskrebs, Hodenkrebs, kleinzelligesLungenkarzinom, nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom, Blasenkarzinom,Epithelialkarzinom, Gliom, Astrozytom, Medulloblastom, Kraniopharyngiom,Ependymom, Pinealom, Hämangioblastom, Akustikusneurinom,Oligodendrogliom, Meningiom, Melanom, Neuroblastom, Retinoblastom,Leukämie, Lymphom oder Kaposi-Sarkom.
Beispielefür proliferative Erkrankungen umfassen hämatopoetischeneoplastische Erkrankungen. Wie hierin verwendet umfasst der Begriff „hämatopoetischeneoplastische Erkrankungen” Krankheiten mit Beteiligungvon hyperplastischen/neoplastischen Zellen hämatopoetischenUrsprungs, beispielsweise aus myeloischer, lymphatischer oder erythroiderAbstammung oder aus deren Vorläuferzellen. Bevorzugt entstehendie Krankheiten aus schlecht differenzierten akuten Leukämien,z. B. aus Erythroblastenleukämie und akuter Megakaryoblastenleukämie.Weitere beispielhafte myeloischen Erkrankungen umfassen, sind abernicht beschränkt auf, akute promyeloische Leukämie(APML), akute myeloische Leukämie (AML) und chronischemyeloische Leukämie (CML) (Übersicht inVaickus (1991), Crit. Rev. Oncol./Hemotol. 11: 267–97);lymphoide Neoplasien umfassen, sind aber nicht beschränktauf, akute lymphatische Leukämie (ALL), B-Lineage-ALL und T-Lineage-ALL,chronische lymphatische Leukämie (CLL), Prolymphozytenleukämie(PLL), Haarzellleukämie (HLL) und Morbus Waldenström(WM). Weitere Formen maligner Lymphome umfassen, sind aber nichtbeschränkt auf, Non-Hodgkin-Lymphom und Varianten davon,periphere T-Zell-Lymphome, adulte T-Zell-Leukämie/Lymphom.(ATL), kutanes. T-Zell-Lymphom (CTCL), große granulärelymphatische Leukämie (LGF), Morbus Hodgkin und Reed-Sternberg-Krankheit.
Beispielefür zelluläre proliferative und/oder differentiativeStörungen der Brust umfassen, sind aber nicht beschränktauf, proliferative Brusterkrankung einschließlich beispielsweiseEpithelhyperplasie, sklerosierende Adenose und kleines Ductuspapillom;Tumoren, wie beispielsweise Stromatumoren wie Fibroadenom, Phylloidestumorund Sarkomen und epitheliale Tumoren wie beispielsweise großesDuctuspapillom, Karzinom der Brust einschließlich in situ(nicht-invasiv) Karzinom, einschließlich duktales Karzinomin situ (einschließlich Morbus Paget) und lobuläresKarzinom in situ sowie invasives (infiltrierendes) Karzinom einschließlich,aber nicht beschränkt auf, invasives duktales Karzinom,invasives lobuläres Karzinom, medulläres Karzinom,Kolloid-(muzinöses)Karzinom, tubuläres Karzinomund invasives papilläres Karzinom und sonstige bösartigeNeoplasmen. Störungen in der männlichen Brustumfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Gynäkomastieund Karzinom.
Beispielefür zelluläre proliferative und/oder differentiativeStörungen der Lunge umfassen, sind aber nicht beschränktauf, Bronchialkarzinom, einschließlich paraneoplastischerSyndrome, bronchioloalveolärem Karzinom, neuroendokrineTumoren wie beispielsweise Bronchialkarzinoid, sonstige Tumorenund metastasische Tumoren; Pathologien der Pleura, einschließlichentzündliche Pleuraergüsse, nicht-entzündlichePleuraergüsse, Pneumothorax und Pleuraltumoren, einschließlichsolitäre fibröse Tumoren (pleurales Fibrom) und malignesMesotheliom.
Beispielefür zelluläre proliferative und/oder differentiativeStörungen des Dickdarms umfassen, sind aber nicht beschränktauf, nicht-neoplastische Polypen, Adenome, familiäre Syndrome,kolorektale Karzinogenese, kolorektales Karzinom und Karzinoid-Tumore.
Beispielefür zelluläre proliferative und/oder differentiativeStörungen der Leber umfassen, sind aber nicht beschränktauf, noduläre Hyperplasien, Adenome und bösartigeTumoren, einschließlich des primären Leberkarzinomsund metastasierte Tumoren.
Beispielefür zelluläre proliferative und/oder differentiativeStörungen des Eierstocks umfassen, sind aber nicht beschränktauf, Ovarialtumoren, wie beispielsweise Tumoren des Zölomepithels,seröse Tumoren, muzinöse Tumoren, endometrioideTumoren, klarzelliges Adenokarzinom, Zystadenofibrom, Brenner Tumor, epithelialeOberflächentumoren, Keimzelltumoren wie reife (benigne)Teratome, monodermale Teratome, unreife maligne Teratome, Dysgerminom,endodermaler Sinustumor, Chorionkarzinom; Keimstrang-Stoma-Tumorenwie Granulosa-Theka-Zell-Tumoren, Thecomafibrom, Androblastome,hill cell-Tumoren und Gonadoblastom; und metastasierte Tumoren wieKrukenberg-Tumoren.
BrustkrebsIneinem Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Behandlung von Brustkrebsdurch Verabreichen der erfindungsgemäßen peptidomimetischenMakrocyclen bereit. Brustkrebs umfasst invasive Mammakarzinome, wiebeispielsweise duktales Karzinom, invasives lobuläres Karzinom,tubuläres Karzinom, invasives Karzinom cribrosa, medulläresKarzinom, muzinöses Karzinom und andere Tumoren mit reichlichMucin, Zystadenokarzinom, muzinöses Karzinom der Cylinderzelle,Siegelringkarzinom, neuroendokrine Tumoren (darunter auch festeneuroendokrine Karzinome, atypische Karzinoidtumoren, kleinzelliges/„oatcell” Karzinom oder großzelliges neuroendokrinesKarzinom), invasives papilläres Karzinom, invasives mikropapilläresKarzinom, apokrines Karzinom, metaplastische Karzinome, reine epithelialemetaplastische Karzinome, gemischte epitheliale/mesenchymale metaplastischeKarzinome, lipidreiches Karzinom, sekretorisches Karzinom, oncocytisches Karzinom,adenoid-zystisches Karzinom, Azinuszellkarzinom, glykogenreichesKlarzellkarzinom, Talgdrüsenkarzinom, inflammatorischesKarzinom oder bilaterales Mammakarzinom; mesenchymale Tumoren wiebeispielsweise Hämangiom, Angiomatose, Haemangiopericytom,pseudoangiomatöse stromale Hyperplasie, Myofibroblastom,Fibromatose (aggressive), entzündlicher myofibroblastärerTumor, Lipom, Angiolipom, Granularzelltumor, Neurofibrom, Schwannom,Angiosarkom, Liposarkom, Rhabdomyosarkom, Osteosarkom, Leiomyomoder Leiomysarkom; myoepitheliale Läsionen wie Myoepitheliose,adenomyoepitheliale Adenose, Adenomyoepitheliom oder malignes Myoepitheliom;fibroepitheliale Tumoren wie Fibroadenom, Phylloidestumor, niedrigesperiduktales Stromasarkom oder Mammahamartom und Tumoren der Brustwarzewie Brustwarzenadenom, syringomatous Adenom oder Morbus Paget derBrustwarze.
DieBehandlung von Brustkrebs kann in Verbindung mit einer zusätzlichenTherapie erfolgen, wie beispielsweise mit einer Therapie, die Teildes Behandlungsstandards ist. Eine chirurgische Technik wie Lumpektomieoder Mastektomie kann vor, während oder nach der Behandlungmit den erfindungsgemäßen peptidomimetischen Makrocyclendurchgeführt werden. Alternativ kann Strahlentherapie fürdie Behandlung von Brustkrebs in Verbindung mit den erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen eingesetzt werden. In anderen Fällenwerden die erfindungsgemäßen peptidomimetischenMakrocyclen in Kombination mit einem zweiten therapeutischen Mittelverabreicht. Ein solches Mittel kann ein Chemotherapeutikum sein,wie ein einzelnes Medikament oder eine Kombination von Medikamentenund Therapien. Zum Beispiel kann das Chemotherapeutikum eine adjuvanteChemotherapie sein, wie beispielsweise CMF (Cyclophosphamid, Methotrexat und5-Fluorouracil); FAC oder CAF (5-Fluorouracil, Doxorubicin, Cyclophosphamid),AC oder CA (Doxorubicin und Cyclophosphamid), AC-Taxol (AC gefolgtvon Paclitaxel); TAC (Docetaxel, Doxorubicin und Cyclophosphamid),FEC (5-Fluorouracil, Epirubicin und Cyclophosphamid); FECD (FECgefolgt von Docetaxel); TC (Docetaxel und Cyclophosphamid). Zusätzlichzum Chemotherapeutikum kann Trastuzumab je nach den Tumoreigenschaften(d. h. HER2/neu Status) und Risiko für einen Rückfallder Therapie hinzugefügt werden. Auch kann Hormontherapievor, während oder nach der chemotherapeutischen Behandlungangezeigt sein. Zum Beispiel kann Tamoxifen verabreicht werden odereine Verbindung aus der Kategorie der Aromatase-Inhibitoren, einschließlich,aber nicht beschränkt auf Aminogluthetimid, Anastrozol,Exemestan, Formestan, Letrozol oder Vorozol. In anderen Ausführungsformenkann ein antiangiogenes Mittel in Kombinationstherapie zur Behandlungvon Brustkrebs eingesetzt werden. Das antiangiogene Mittel kannein anti-VEGF-Mittel sein, einschließilch, aber nicht beschränktauf, Bevacizumab.
EierstockkrebsIneinem anderen Aspekt können die erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen zur Behandlung von Eierstockkrebsverwendet werden. Eierstockkrebs umfasst Ovarialtumoren wie beispielsweise Zölomepitheltumoren,seröse Tumoren, muzinöse Tumoren, endometrioideTumoren, klarzelliges Adenokarzinom, Cystadenofibrom, Brenner-Tumor,epitheliale Oberflächentumoren, Keimzelltumoren wie beispielsweise reife(benigne) Teratome, monodermale Teratome, unreife maligne Teratome,Dysgerminom, endodermaler Sinustumor, Chorionkarzinom; Keimstrang-Stoma-Tumorenwie Granulosa-Theka-Zell-Tumoren, Thecomafibrome, Androblastomae,hill cell-Tumoren und Gonadoblastom und metastasierte Tumoren wieKrukenberg-Tumoren.
Dieerfindungsgemäßen peptidomimetischen Makrocyclenkönnen in Verbindung mit einer zusätzlichen Therapieverabreicht werden, wie beispielsweise mit einer Therapie, die Teildes Behandlungsstandards ist. Chirurgische Eingriffe, Immuntherapie,Chemotherapie, Hormontherapie, Strahlentherapie oder eine Kombinationdavon sind mögliche Behandlungen für Eierstockkrebs.Zu den möglichen chirurgischen Eingriffen zählenDebulking und unilaterale oder bilaterale Oophorektomie und/oderunilaterale oder bilaterale Salpigektomie.
Anti-Krebs-Medikamente,die möglicherweise eingesetzt werden, umfassen Cyclophosphamid,Etoposid, Altretamin und Ifosfamid. Hormontherapie mit dem MedikamentTamoxifen kann zum Schrumpfen von Ovarialtumoren eingesetzt werden.Strahlentherapie kann externe Strahlentherapie und/oder Brachytherapie sein.
ProstatakrebsIneinem anderen Aspekt können die erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen zur Behandlung von Prostatakrebsverwendet werden. Prostatakarzinome umfassen Adenokarzinome undmetastasierte Adenokarzinome. Die erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen können in Verbindung mit einerzweiten Therapie verabreicht werden, wie mit einer Therapie, dieTeil des Behandlungsstandards ist. Eine Prostatakrebsbehandlungkann mit chirurgischen Eingriffen, Strahlentherapie, High IntensityFocused Ultrasound (HIFU), Chemotherapie, Kryochirurgie, Hormontherapieoder einer Kombination davon verbunden sein. Chirurgische Eingriffekönnen mit Prostatektomie, radikaler perinealer Prostatektomie,laparoskopischer radikaler Prostatektomie, transurethraler Resektionder Prostata oder Orchiektomie verbunden sein. Die Strahlentherapiekann auch externe Strahlentherapie und/oder Brachytherapie umfassen.Hormontherapie kann Orchiektomie; die Verabreichung von Antiandrogenewie Flutamid, Bicalutamid, Nilutamid oder Cyproteronacetat umfassen;Medikamente, die die Produktion von adrenalen Androgenen hemmen,wie beispielsweise DHEA, wie beispielsweise Ketoconazol und Aminoglutethimid;und GnRH-Antagonisten oder Agonisten wie Abarelix (Plenaxis®), Cetrorelix (Cetrotide®), Ganirelix (Antagon®),Leuprolid, Goserelin, Triptorelin oder Buserelin. Die Behandlungmit einem Anti-Androgenmittel, welches die Androgenaktivitätim Körper beeinträchtigt, steht ebenfalls alsTherapie zur Verfügung. Diese Mittel umfassen Flutamid,Bicalutamid und Nilutamid. Diese Therapie wird in der Regel mitder Verabreichung von LHRH-Analoga oder einer Orchiektomie kombiniert,was als kombinierte Androgenblockade (CAB) bezeichnet wird. Chemotherapieumfasst, ist aber nicht beschränkt auf, die Gabe von Docetaxel,beispielsweise mit einem Kortikosteroid wie beispielsweise Prednison.Anti-Krebs-Medikamente wie Doxorubicin, Estramustin, Etoposid, Mitoxantron,Vinblastin, Paclitaxel, Carboplatin können auch verabreichtwerden, um das Wachstum von Prostatakrebs zu verlangsamen, Symptomezu verringern und die Lebensqualität zu verbessern. Zusätzlichkönnen Verbindungen wie Bisphosphonate verabreicht werden.
NierenkrebsIneinem anderen Aspekt können die erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen zur Behandlung von Nierenkrebs verwendetwerden. Krebserkrankungen der Nieren umfassen, sind aber nicht beschränktauf, Nierenzellkarzinome, Metastasen aus extra-renale primärenNeoplasien, Nierenlymphome, Plattenepithelkarzinome, juxtaglomeruläreTumoren (Reninome), Übergangszellkarzinome, Angiomyolipome,Onkozytome und Wilms-Tumoren. Die erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen können in Verbindung miteiner zweiten Therapie verabreicht werden, wie beispielsweise miteiner Therapie, die Teil des Behandlungsstandards ist. Die Behandlungvon Nierenkrebs kann mit chirurgischen Eingriffen, perkutanen Therapien,Strahlentherapien, Chemotherapie, Impfstoffen oder anderen Medikamentenverbunden sein. Chirurgische Techniken, die nützlich fürdie Behandlung von Nierenkrebs in Kombination mit den erfindungsgemäßen peptidomimetischenMakrocyclen sind, umfassen Nephrektomie, welche möglicherweisemit der Entfernung der Nebenniere, retroperitonealen Lymphknotenund anderen umgebenden Geweben, die durch die Invasion des Tumorsbeeinträchtigt wurden, verbunden ist. Perkutane Therapienumfassen beispielsweise durch Bildgebung geleitete Therapien, welchemit Bildgebung eines Tumors gefolgt von seiner gezielten Zerstörung durchRadiofrequenzablation oder Kryotherapie verbunden sein können.In einigen Fällen können andere Chemotherapeutikaoder andere Medikamente, die sich bei der Behandlung von Nierenkrebsals nützlich erweisen, Interferon-alpha, Interleukin-2,Bevacizumab, Sorafenib, Sunitib, Temsirolimus oder anderen Kinase-Inhibitorenumfassen.
BauchspeicheldrüsenkrebsInanderen Aspekten stellt die Erfindung Verfahren zur Behandlung vonBauchspeicheldrüsenkrebs durch Verabreichung von erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen bereit, wie beispielsweise ein nachfolgendausgewähltes Pankreaskarzinom: ein epitheliodes Karzinomim Gewebe des Pankreasgangs und ein Adenokarzinom in einem Pankreasgang.Die häufigste Art von Bauchspeicheldrüsenkrebsist ein Adenokarzinom, das in der Auskleidung der Pankreasgang auftritt.Mögliche Behandlungen für Bauchspeicheldrüsenkrebsumfassen chirurgische Eingriffe, Immuntherapie, Strahlentherapieund Chemotherapie. Zur Verfügung stehende chirurgischeBehandlungsmethoden umfassen distale oder totale Pankreatektomieund Duodenopankreatektomie (Whipple-Verfahren). Strahlentherapiestellt eine Option für Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebsdar, insbesondere externe Strahlentherapie, bei der Strahlung aufden Tumor durch eine Maschine außerhalb des Körperskonzentriert wird. Eine weitere Option ist die intraoperative Elektronenbestrahlung,die während einer Operation angewendet wird. Chemotherapiekann ebenfalls in der Behandlung von Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebseingesetzt werden. Geeignete Anti-Krebs-Medikamente umfassen, sind abernicht beschränkt auf, 5-Fluorouracil (5-FU), Mitomycin,Ifosfamid, Doxorubicin, Streptozocin, Chlorozotocin und Kombinationendavon. Die durch die Erfindung bereitgestellten. Verfahren könnendurch Verabreichung eines erfindungsgemäßen Polypeptidsoder durch eine Kombination von Verabreichung eines peptidomimetischenMakrocyclus und chirurgischen Eingriffen, Strahlentherapie oderChemotherapie eine positive Wirkung auf Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebshaben.
DarmkrebsIneinem Aspekt können erfindungsgemäßepeptidomimetische Makrocyclen in der Behandlung von Darmkrebs eingesetztwerden, einschließlich, ohne darauf beschränktzu sein, bei nicht-neoplastischen Polypen, Adenome, familiäreSyndrome, kolorektaler Karzinogenese, kolorektalem Karzinom undKarzinoidtumoren. Mögliche Behandlungen für Darmkrebs,die in Verbindung mit den erfindungsgemäßen peptidomimetischenMakrocyclen verwendet werden können, umfassen chirurgischeEingriffe, Chemotherapie, Strahlentherapie oder gezielte medikamentöseBehandlung.
Strahlentherapiekann auch externe Strahlentherapie und/oder Brachytherapie umfassen.Chemotherapie kann verwendet werden, um die Wahrscheinlichkeit derEntwicklung von Metastasen zu verringern, um Tumorgrößezu verringern oder um das Tumorwachstum zu verlangsamen. Chemotherapiewird häufig nach dem chirurgischen Eingriff (adjuvanteBehandlung), vor dem chirurgischen Eingriff (neo-adjuvant) oderals primäre Therapie, wenn eine chirurgischer Eingriffnicht indiziert ist (palliativ) eingesetzt. Beispielsweise umfassenbeispielhafte Behandlungsschemen bei adjuvanter Chemotherapie dieKombination von durch Infusion verabreichtem 5-Fluorouracil, Leucovorinund Oxaliplatin (FOLFOX). Behandlungsschemen bei First-line Chemotherapieumfassen möglicherweise die Kombination von durch Infusionverabreichten 5-Fluorouracil, Leucovorin und Oxaliplatin (FOLFOX)mit einem zielgerichteten Medikament wie Bevacizumab, Cetuximaboder Panitumumab oder durch Infusion verabreichtem 5-Fluorouracil,Leucovorin und Irinotecan (FOLFIRI) mit zielgerichteten Medikamentenwie Bevacizumab, Cetuximab oder Panitumumab. Zu anderen Chemotherapeutika,die möglicherweise bei der Behandlung oder Präventionvon Darmkrebs in Kombination mit den erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen nützlich sind, zählenBortezomib (Velcade®), Oblimersen(Genasense®, G3139), Gefitinibund Erlotinib (Tarceva®) und Topotecan(Hycamtin®).
LungenkrebsEinigeAusführungsformen stellen Verfahren für die Behandlungvon Lungenkrebs mit den erfindungsgemäßen peptidomimetischenMakrocyclen bereit. Beispiele für zelluläre proliferativeund/oder differentiative Störungen der Lunge umfassen,sind aber nicht beschränkt auf, Bronchialkarzinom, einschließlichparaneoplastische Syndromen, bronchioloalveolärem Karzinom,neuroendokrine Tumoren wie beispielsweise Bronchialkarzinoid, sonstigeTumoren und metastasierte Tumoren; Pathologien der Pleura, einschließlichentzündliche Pleuraergüsse, nicht-entzündlichePleuraergüsse, Pneumothorax und pleurale Tumoren, einschließlich solitärefibröse Tumoren (pleurale Fibrome) und malignes Mesotheliom.
Diehäufigste Art von Lungenkrebs ist nicht-kleinzelliger Lungenkrebs(NSCLC), der rund 80–85% aller Lungenkrebsfälleausmacht und in Plattenepithelkarzinome, Adenokarzinome und großzelligeundifferenzierte Karzinome unterteilt wird. Auf kleinzelligen Lungenkrebswie beispielsweise kleinzellige Lungenkarzinome entfallen 15–20%der Lungenkrebserkrankungen. Behandlungsmöglichkeiten fürLungenkrebs umfassen chirurgische Eingriffe, Immuntherapie, Strahlentherapie,Chemotherapie, photodynamische Therapie oder eine Kombination davon.Zu den möglichen Optionen für eine. chirurgischeBehandlung von Lungenkrebs zählen segmentale oder Keilresektion,Lobektomie oder Pneumonektomie. Strahlentherapie kann externe Strahlentherapieoder Brachytherapie sein. Zu den AntiKrebs-Medikamenten, die alsChemotherapie bei der Behandlung von Lungenkrebs in Kombinationmit den erfindungsgemäßen peptidomimetischen Makrocycleneingesetzt werden können, zählen Cisplatin, Carboplatin,Paclitaxel, Docetaxel, Gemcitabin, Vinorelbin, Irinotecan, Etoposid,Vinblastin, Gefitinib, Ifosfamid, Methotrexat oder eine Kombinationdavon. Photodynamische Therepie (PDT) kann in der Behandlung vonLungenkrebspatienten eingesetzt werden. Die hier beschriebenen Verfahrenkönnen durch Verabreichung eines peptidomimetischen Makrocyclusoder einer Kombination von Verabreichung eines. peptidomimetischenMakrocyclus und chirurgischen Eingriff, Strahlentherapie, Chemotherapie,photodynamischer Therapie oder einer Kombination davon eine positiveWirkung auf Patienten mit Lungenkrebs haben.
Beispielefür zelluläre proliferative und/oder differentiativeStörungen der Leber umfassen, sind aber nicht beschränktauf, noduläre Hyperplasien, Adenome und bösartigeTumoren, einschließlich primärem Leberkarzinomund metastasierten Tumoren.
Immunproliferative StörungenImmunproliferativeStörungen (auch als „immunproliferative Krankheiten” oder ”immunproliferativeNeoplasmen” bezeichnet) sind Störungen des Immunsystems,die durch die abnorme Wucherung der primären Zellen desImmunsystems, zu denen die B-Zellen, die T-Zellen und Natural Killer(NK) Zellen gehören oder durch die übermäßigeProduktion von Immunglobulinen (auch als Antikörper bezeichnet)gekennzeichnet sind. Solche Störungen umfassen die allgemeinenKategorien von lymphoproliferativen Störungen, Hypergammaglobulinemienund Paraproteinemien. Beispiele solcher Störungen umfassen,sind aber nicht beschränkt auf, X-linked lymphoproliferativeStörung, autosomale lymphoproliferative Störung,Hyper-IgM-Syndrom, Schwerkettenerkrankung und Kryoglobulinämie.Weitere immunproliferative Störungen sind Graft-versus-Host-Erkrankung(GvHD), Psoriasis, Immunstörungen, die mit Transplantatabstoßungverbunden sind; T-Zell-Lymphom; akute lymphatische T-Zell-Leukämie,angiozentrisches T-Zell-Lymphom der Hoden; benigne lymphozytäreVaskulitis und Autoimmunerkrankungen wie Lupus erythematodes, Hashimoto-Thyreoiditis,primäres Myxödem, Morbus Basedow, perniziöseAnämie, autoimmune atrophische Gastritis, Morbus Addison,insulinabhängiger Diabetes mellitus, Goodpasture-Syndrom,Myasthenia gravis, Pemphigus, Morbus Crohn, sympathische Ophthalmie,Autoimmunuveitis, Multiple Sklerose, autoimmunhämolytischeAnämie, idiopathische Thrombozytopenie, primärbiliäre Zirrhose, Autoimmunhepatitis, ulzerative Collitis,Sjögren-Syndrom, rheumatoide Arthritis, Polymyositis, Sklerodermieund gemischte Bindegewebskrankheit.
KombinationsbehandlungenIneiner Ausführungsform können erfindungsgemäßepeptidomimetische Makrocyclen für die Behandlung von Krebsin Verbindung mit alkylierenden Mitteln sowie mit Mitteln, die ähnlichwie alkylierende Mittel wirken, verwendet werden. Solche Substanzenumfassen beispielsweise Stickstoffloste wie beispielsweise Chlorambucil,Chlormethin, Cyclophosphamid, Ifosfamid und Melphalan; Nitrosoharnstoffverbindungenwie beispielsweise Carmustin, Fotemustin, Lomustin und Streptozocin;Platin-Therapeutika wie Carboplatin, Cisplatin, Oxaliplatin, BBR3464und Satraplatin; oder andere Wirkstoffe, einschliesslich, aber nichtbeschränkt auf, Busulfan, Dacarbazin, Procarbazin, Temozolomid,Thiotepa, Treosulfan oder Uramustin.
Ineiner weiteren Ausführungsform können erfindungsgemäßepeptidomimetische Makrocyclen in Verbindung mit einem Antineoplastikum,das ein Antimetabolit ist, eingesetzt werden. Beispielsweise kannein solches Antineoplastikum eine Folsäure wie Aminopterin,Methotrexat, Pemetrexed oder Raltitrexed sein. Alternativ kann dasAntineoplastikum ein Purin wie, einschließlich aber nichtbegrenzt auf, Cladribin, Clofarabin, Fludarabin, Mercaptopurin,Pentostatin, Thioguanin sein. In weiteren Ausführungsformenkann das Antineoplastikum ein Pyrimidin wie Capecitabin, Cytarabin,Fluorouracil, Floxuridin und Gemcitabin sein.
Innoch anderen Ausführungsformen können erfindungsgemäßepeptidomimetische Makrocyclen in Verbindung mit einem Antineoplastikum,das ein Spindelgift/mitotischer Inhibitor ist, verwendet werden.Mittel in dieser Kategorie umfassen Taxane, wie beispielsweise Docetaxelund Paclitaxel; und Vincaalkaloide wie Vinblastin, Vincristin, Vindesinund Vinorelbin. In wieder anderen Ausführungsformen könnenerfindungsgemäße peptidomimetische Makrocyclenin Kombination mit einem Antineoplastikum, das ein zytotoxisches/Antitumorantibiotikumaus der Familie der Anthracycline ist, wie beispielswiese Daunorubicin,Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin, Mitoxantron, Pixantron oderValrubicin, verwendet werden; ein Antibiotikum aus der Streptomyces-Familiewie beispielsweise Actinomycin, Bleomycin, Mitomycin oder Plicamycin;oder Hydroxyurea. Alternativ können die für dieKombinationstherapie verwendeten Mittel Topoisomerasehemmer einschließlich,aber nicht beschränkt auf, Camptothecin, Topotecan, Irinotecan,Etoposid oder Teniposid sein.
Alternativkann das Antineoplastikum ein Antikörper oder ein von einemAntikörper abgeleitetes Mittel sein. Beispielsweise kannein Antikörper gegen Rezeptor-Tyrosinkinase wie beispielsweiseCetuximab, Panitumumab oder Trastuzumab verwendet werden. Alternativkann der Antikörper ein Anti-CD20-Antikörper wie beisppielsweiseRituximab oder Tositumomab sein oder jeder andere geeignete Antikörper,einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Alemtuzumab, Bevacizumabund Gemtuzumab. In anderen Ausführungsformen ist das Antineoplastikumein Photosensibilisator wie beispielsweise Aminolävulinsäure,Methylaminolaevulinat, Porfimer-Natrium oder Verteporfin. In wiederanderen Ausführungsformen ist das Antineoplastikum einTyrosinkinase-Inhibitor, wie Dediranib, Dasatinib, Erlotinib, Gefitinib,Imatinib, Lapatinib, Nilotinib, Sorafenib, Sunitinib oder Vandetanib.Andere neoplastische Mittel, die für die Benutzung derErfindung geeignet sind, umfassen beispielsweise Alitretinoin, Tretinoin,Altretamin, Amsacrin, Anagrelid, Arsentrioxid, Asparaginase (Pegaspargase),Bexaroten, Bortezomib, Denileukin diftitox, Estramustin, Ixabepilon,Masoprocol oder Mitotan.
Inanderen oder weiteren Ausführungsformen werden die hierinbeschriebenen peptidomimetischen Makrocyclen zur Behandlung, Präventionoder Diagnose von Zuständen verwendet, die durch überaktiven Zelltododer Zelltod durch physiologische Beeinträchtigung usw.gekennzeichnet sind. Einige Beispiele von Zuständen, diedurch vorzeitigen oder unerwünschten Zelltod gekennzeichnetsind oder alternativ durch unerwünschte oder übermäßigeZellproliferation, umfassen, ohne darauf beschränkt zusein, hypozelluläre/hypoplastische, azelluläre/aplastischeoder hyperzeliuläre/hyperplastische Zustände.Beispiele umfassen hämatologische Störungen einschließlich,aber nicht beschränkt auf, Fanconi-Anämie, aplastischeAnämie, Thalassämie, kongenitale Neutropenie,Myelodysplasie.
Inanderen oder weiteren Ausführungsformen werden die erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen, die eine anti-apoptotische Wirkungbesitzen, verwendet, um Störungen zu behandeln, die miteinem unerwünschten Maß an Zelltod in Zusammenhangstehen. Somit werden in einigen Ausführungsformen die erfindungsgemäßenanti-apoptotisch wirkenden peptidomimetischen Makrocyclen verwendet,um Störungen zu behandeln, wie beispielsweise diejenigen,die zu mit Virusinfektion assoziiertem Zelltod führen,beispielsweise eine Infektion, die mit Infektion mit dem humanenImmundefizienz-Virus (HIV) assoziiert ist. Eine Vielzahl von neurologischenErkrankungen ist durch den allmählichen Verlust von spezifischenGruppen von Neuronen gekennzeichnet, wobei die erfindungsgemäßenanti-apoptotischen peptidomimetischen Makrocyclen in einigen Ausführungsformenverwendet werden, um solche Störungen zu behandeln. SolcheStörungen umfassen Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson,Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Retinitis pigmentosa, spinaleMuskelatrophie und verschiedene Formen der Degeneration des Kleinhirns.Der Zellverlust bei diesen Erkrankungen induziert keine entzündlicheReaktion und Apoptose ist vermutlich der Mechanismus des Zelltods. Darüberhinaus sind eine Reihe von hämatologischen Erkrankungenmit einer verminderten Produktion von Blutzellen assoziiert. DieseErkrankungen umfassen Anämie bei chronischer Erkrankung,aplastische Anämie, chronische Neutropenie und die myelodysplastischenSyndrome. Störungen der Blutbildung wie beispielsweisemyelodysplastisches Syndrom und einige Formen von aplastischer Anämiesind mit erhöhtem apoptotischen Zelltod innerhalb des Knochenmarksverbunden. Diese Störungen könnten auf Aktivierungvon Genen, die Apoptose fördern, erworbene Mängelin Stromazellen oder hämatopoetische Überlebensfaktorenoder die direkten Auswirkungen von Toxinen und Mediatoren der Immunantwortzurückzuführen sein. Zwei häufige, mit Zelltodassoziierte Erkrankungen sind Herzinfarkt und Schlaganfäll.Bei beiden Störungen scheinen Zellen im zentralen Bereichder Ischämie, die im Falle eines akuten Verlusts des Blutflusseserzeugt wird, schnell als Folge der Nekrose zu sterben. Außerhalbder zentralen ischämischen Zone jedoch sterben Zellen übereinen längeren Zeitraum und scheinen morphologisch durchApoptose zu sterben.
Sonstige VerwendungenInweiteren oder anderen Ausführungsformen werden die erfindungsgemäßenanti-apoptotischen peptidomimetischen Makrocyclen zur Behandlungvon Störungen verwendet, die mit unerwünschtemZelltod assoziiert sind.
EinigeBeispiele von immunologischen Störungen, die mit den hierinbeschrieben peptidomimetischen Makrocyclen behandelt werden, umfassen,ohne darauf beschränkt zu sein, Organtransplantatabstoßung,Arthritis, Lupus, CED, Morbus Crohn, Asthma, Multiple Sklerose,Diabetes usw.
EinigeBeispiele für neurologische Störungen, die mitden hierin beschriebenen peptidomimetischen Makrocyclen behandeltwerden, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, MorbusAlzheimer, Down-Syndrom, hereditäre zerebrale Haemorrhagiemit Amyloidose niederländischer Typ, Reaktive Amyloidose,Familiäre Amyloidnephropathie mit Urticaria und Taubheit,Muckle-Wells-Syndrom, idiopathisches Myelom; makroglobulinämieassoziiertesMyelom, Familiäre Amyloidpolyneuropathie, familiäreAmyloidkardiomyopathie, isoliertes-Amyloid des Herzens, systemischesenile Amyloidose, Altersdiabetes, Insulinom, isoliertes Atrialamyloid, medulläresKarzinom der Schilddrüse, familiäre Amyloidose,hereditäre zerebrale Hämorrhagie mit Amyloidose,familiäre amyloidotische Polyneuropathie, Scrapie, Creutzfeldt-Jakob-Krankheit,Gerstmann-Straussler-Scheinker-Syndrom, bovine spongiforme Enzephalopathie,eine prionvermittelte Erkrankung und Chorea Huntington.
EinigeBeispiele für endokrinologische Störungen, diemit den hierin beschriebenen peptidomimetischen Makrocyclen behandeltwerden, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Diabetes,Schilddrüsenunterfunktion, Hypophyseninsuffizienz, Hypoparathyreoidismus,Hypogonadismus usw.
Beispielefür Herz-Kreislauf-Störungen (z. B. entzündlicheErkrankungen), die mit den erfindungsgemäßen peptidomimetischenMakrocyclen behandelt oder verhindert werden, umfassen, ohne daraufbeschränkt zu sein, Arteriosklerose, Herzinfarkt, Schlaganfall,Thrombose, Aneurysma, Herzinsuffizienz, koronare Herzkrankheit,Angina pectoris, plötzlicher Herztod, hypertensive Herzkrankheit,nicht-koronare Gefäßerkrankung wie beispielsweiseArteriolosclerosis, Small-Vessel-Disease, Nephropathie, Hypertriglyzeridämie, Hypercholesterinämie,Hyperlipidämie, Xanthomatose, Asthma, Bluthochdruck, Emphysemund chronische Lungenerkrankungen, Herz-Kreislauf-Zustand im Zusammenhangmit interventionellen Verfahren („prozedurbedingtes vaskuläresTrauma”), wie Restenose nach Angioplastie, Platzierungeines Shunt, Stent, synthetischer oder natürlicher Exzisionstransplantate,Dauerkatheter, Ventil oder anderer implantierbare Geräte.Bevorzugte Herz-Kreislauf-Störungen umfassen Arteriosklerose,Herzinfarkt, Aneurysma und Schlaganfall.
BEISPIELEImfolgenden Abschnitt wird die vorliegende Erfindung anhand von Beispielenerläutert.
Beispiel 1. Synthese von erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen.α-HelikaleBID- und BIM-peptidomimetische Makrocyclen wurden nach bekanntenVerfahren synthetisiert, gereinigt und analysiert (Walenskyet al. (2004) Science 305: 1466–70; Walenskyet al. (2006) Mol Cell 24: 199–210) sowie wieunten angegeben. Die in dieser Studie verwendeten Makrocyclen sindnachfolgend dargestellt. Die entsprechenden unvernetzten Polypeptidewerden als „WT-Sequenz” bezeichnet und stellen dasnatürliche Gegenstück zu den erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen dar.
Alpha,alpha-disubstituierte nichtnatürliche Aminosäurenmit olefinischen Seitenketten wurden nach Williams et al.(1991) J. Am. Chem. Soc. 113: 9276; und Schafmeisteret al. (2000) J. Am. Chem. Soc. 122: 5891 hergestellt.BID-BH3 und BIM-BH3 peptidomimetischen Makrocyclen wurden durchErsatz von zwei natürlich vorkommenden Aminosäurenmit den entsprechenden synthetischen Aminosäuren erhalten.Substitutionen erfolgten an Positionen i und i + 4. BID-BH3 undBIM-BH3 Makrocyclen wurden durch Festphasensynthese, gefolgt vonOlefin-Metathese-basierter Vernetzung der synthetischen Aminosäuren überihre olefinhaltigen Seitenketten hergestellt. Die Kontrollsequenzenfür BID und BIM peptidomimetische Makrocyclen sowie spezifischeSequenzmutationen werden vorstehend gezeigt.
Inden gezeigten Sequenzen steht „Nle” fürNorleucin, „Aib” steht für 2-Aminoisobuttersäure, „Chg” stehtfür Cyclohexylglycin, „Ac” steht fürAcetyl und „Pr” steht für Propionyl.Aminosäuren, die als $ dargestellt sind, verbinden einennur aus Kohlenstoff bestehenden Vernetzer, der eine Doppelbindung umfasstund wobei jedes α-Kohlenstoffatom, an das der Vernetzergebunden ist, zusätzlich mit einer Methylgruppe substituiertist. In allen Fällen ist der Vernetzer ein linearer nuraus Kohlenstoff bestehender Vernetzer mit acht Kohlenstoffatomenzwischen den Alpha-Kohlenstoffatomen der einzelnen Aminosäuren.Wenn eine Doppelbindung vorhanden ist, befindet sich diese zwischendem vierten und fünften Kohlenstoffatom.
Dienicht-natürlichen Aminosäuren (R- und S-Enantiomereder 5-Kohlenstoff-olefischen Aminosäure und das S-Enantiomerder 8-Kohlenstoff-olefinischen Aminosäure) wurden durchKernresonanzspektroskopie (NMR)/Varian Mercury 400) und Massenspektrometrie(Micromass LCT) charakterisiert. Die Peptidsynthese wurde entwedermanuell oder mit einem automatischen Peptidsynthetisierer (AppliedBiosystems, Modell 433A) unter Festphasenbedingungen, Rink AmideAM-Harz (Novabiochem) und Fmoc-Schutzgruppenchemie fürdie Hauptkette durchgeführt. Zum Koppeln der natürlichenFmoc-geschützten Aminosäuren (Novabiochem) wurden10 Äquivalente Aminosäure und ein Molverhältnisder Kopplungsreagentien HBTU/HOBt (Novabiochem)/DIEA von 1:1:2 verwendet.Nicht-natürliche Aminosäuren (4 Äquivalente)wurden mit einem Molverhältnis von 1:1:2 von HATU (AppliedBiosystems)/HOBt/DIEA gekoppelt. Die Olefin-Metathese wurde in derfesten Phase mit 10 mM Grubbs-Katalysator (Blackewell etal. 1994 supra) (Strem Chemicals), gelöst in entgastem Dichlormethan,durchgeführt und 2 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt.Die Isolation der Metathese-Produktverbindungen wurde durch Trifluoressigsäure-vermitteltesEntschützen und Spalten, Ausfällen in Ether, umdas Rohprodukt zu ergeben, sowie Hochleistungs-Flüssigchromatographie(HPLC) (Varian ProStar) an einer Reversed Phase-C18-Säule(Varian) erreicht und ergab die reinen Verbindungen. Die chemischeZusammensetzung der reinen Produkte wurde durch LC/MS Massenspektrometrie(Micromass LCT mit Schnittstelle zum Agilent 1100 HPLC System) undAminosäurenanalyse (Applied Biosystems, Modell 420A) bestätigt.
Zelllinien:Diein dieser Untersuchung verwendeten Zelllinien sind in der folgendenTabelle wiedergegeben: ZellenTypQuelleJurkatHumaneakute T-Zellen-LeukämieATCCK562Humanechronische myelogene LeukämieATCCKarpas299HumanesT-Zellen-LymphomATCCMOLT4HumaneT-Zellen-LeukämieNCIRPMI8226HumanesB-LymphoblastomNCIRamosHumanesB-Zellen-LymphomATCCRajiHumanesB-Zellen-LymphomATCCHL-60Humanemyeloische LeukämieNCIMahne-3MMalignesMelanom LungeNCISKMEL2Humanesmalignes MelanomNCISKMEL5Humanesmalignes MelanomNCIPC3HumanesProstataadenokarzinomNCICaki1Humanesklarzelliges NierenkarzinomNCIZellenTypQuelleHCT116HumanesKolorektalkarzinomNCIHT-29KolorektalesAdenokarzinomNCIHEPG2Humaneshepatozelluläres KarzinomATCCMDAMB231HumanesBrustadenokarzinomNCIMCF7HumanesBrustadenokarzinomNCIA549Humanesnicht-kleinzelliges LungenkarzinomNCIH460Humanesnicht-kleinzelliges LungenkarzinomNCINCI-H220Humaneskleinzelliges LungenkarzinomNCINCI-H146Humaneskleinzelliges LungenkarzinomNCINCI-H128Humanerkleinzelliger LungenkrebsATCCSKOV3HumanesEierstock-AdenokarzinomNCIPanc-1HumanesPankreaskarzinomATCCU251HumanesGlioblastomATCCNCI-H82Humaneskleinzelliges LungenkarzinomSupt1HumanesT-Zellen-LymphomDHL-6HumanesB-Zellen-LymphomRS4;11Humanelymphoblastische LeukämieMM1SHumanesmultiples MyelomSEMK2HumaneMixed Lineage-LeukämieA375Humanesmalignes MelanomOVCAR8HumanesEierstockkarzinom
Beispiel 2. Zellentwicklungsfähigkeits-Assays:Diein den 1–32 gezeigtenZellentwicklungsfähigkeits-Tests wurden gemäß demfolgenden Protokoll durchgeführt. Die Tumorzelllinien wurdennach Bedarf in spezifischen Serum-supplementierten Medien (Wachstumsmedien)gezüchtet. Am Tag vor Beginn der Untersuchung wurden dieZellen in optimaler Zelldichte (15.000 bis 25.000 Zellen/Mulde)in Mikrotiterplatten in 200μLWachstumsmedium ausgestrichen. Am nächsten Tag wurden dieZellen zweimal in serumfreiem/phenolrotfreiem RPMI-Komplettmedium(Assay-Puffer) gewaschen und jeder Mulde wurde ein Endvolumen von100 μL Assaypuffer zugefügt. Humane periphere Blutlymphozyten(hPBLs) wurden aus Buffy-Coats (San Diego Blutbank) mittels Ficoll-Paque-Gradiententrennungisoliert und am Tag des Experiments in 25.000 Zellen/Mulde ausgestrichen.
Diepeptidomimetischen Makrocyclen wurden aus 1 mM Vorratslösungen(100% DMSO) in sterilem Wasser verdünnt, um 400 μMArbeitslösungen herzustellen. Die peptidomimetischen Makrocyclenund Kontrollen wurden dann 10- oder 40-fach verdünnt oderalternativ seriell zweifach in Assay-Puffer in Dosierplatten verdünnt,um Konzentrationen von 40 oder 20 μM beziehungsweise zwischen1,2 und 40 μM zu liefern. Den entsprechenden Mulden derTestplatte wurden dann 100 μL von jeder Verdünnungzugefügt, um Endkonzentrationen der peptidomimetischenMakrocyclen entsprechend 20 oder 5 μM beziehungsweise zwischen0,6 und 20 μM zu ergeben. Die Kontrollen beinhalteten Muldenohne peptidomimetische Makrocyclen, die die gleiche DMSO-Konzentrationwie die Mulden mit den peptidomimetischen Makrocyclen enthielten,Mulden, die 0,1% Triton X-100 enthielten, Mulden, die einen Chemococktailenthielten, der aus 1 μM Velcade, 100 μM Etoposidund 20 μM Taxol zusammengesetzt war und Mulden, die keineZellen enthielten. Die Platten wurden 4 Stunden bei 37°Cin angefeuchteter Atmosphäre mit 5% CO2 inkubiert.
AmEnde der vierstündigen Inkubationszeit wurden jeder Mulde22 μL FBS zugefügt, um eine Gesamtkonzentrationvon 10% FBS zu ergeben. Nach Zugabe des Serums wurden die Plattenweitere 44 Stunden bei 37°C in angefeuchteter Atmosphäremit 5% CO2 inkubiert. Am Ende der Inkubationsperiodewurde der MTT-Assay gemäß den Herstelleranweisungen(Sigma, Katalog Nr. M2128) durchgeführt, und die Extinktion wurdebei 560 nm mit einem Dynex Opsys MR Plattenableser gemessen.
Inden 1-3 sind die Werte als ProzentZytotoxizität aufgetragen, d. h. als Prozentsatz der positivenKontrolle entsprechend 100% Zelltod. In den 4-15, 25 und 26 sinddie Werte als Prozent Entwicklungsfähige aufgetragen, d.h. als Prozent der Negativkontrolle entsprechend 100% entwicklungsfähigenZellen. Alle Assays wurden in Viererreihen durchgeführt.
1 zeigthumane Tumorzelllinien, die mit SP-1 (20 μM) behandeltwurden und deren Zellentwicklungsfähigkeit durch einenMTT-Assay 48 Stunden nach Zugabe des Testartikels bewertet wurde.Alle getesteten Leukämie/Lymphom-Zelllinien reagiertenempfindlich auf SP-1. Zusätzlich induzierte SP-1 auch dieApoptose mehrerer solider Tumorlinien, darunter drei kleinzelligeLungenkarzinom-(SCLC)-Linien, NCI-H220, NCI-H128 und NCI-H146. ImGegensatz dazu gab es mehrere solide Tumorlinien, die resistentgegen SP-1 waren, darunter die nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom-(NSCLC)LinienA-549 und H-460, MCF7 (Brustkrebs) und U251 (Gliom). 2 zeigtsieben humane Leukämie/Lymphom-Zelllinien, die 48 Stundenmit 5 μM entweder SP-1 oder SP-4 behandelt wurden und derenZellentwicklungsfähigkeit untersucht wurde. Alle Zelllinien wieseneine ähnliche Empfindlichkeit gegen beide Makrocyclen indieser Konzentration auf, wie gezeigt wird.
3 zeigtzwölf humane solide Tumorlinien, deren Sensitivitätgegen SP-1 oder SP-4 (20 μM) getestet wurde. Es scheinthier, wie gezeigt, ein zellspezifischer Unterschied der Empfindlichkeitgegen jeden getesteten Makrocyclus vorzuliegen. Die EC50-Kurvenfür SP-1, SP-2, SP-3, SP-4, SP-5 und SP-6 fürindividuelle Zelllinien sind in den 4–15 gezeigt.
Diein den 34–52 gezeigtenZellentwicklungsfähigkeits-Assays wurden gemäß einem ähnlichenProtokoll durchgeführt. Die Zellen wurden bei optimalerZelldichte einen Tag vor Beginn der Untersuchung aufgeteilt. Amnächsten Tag wurden die Zellen zwei Mal in serumfreiemOpti-MEM-Medium gewaschen, und jeder Mulde wurden 4000 Zellen/Muldein einem Endvolumen von 100 μl Opti-MEM zugegeben. DieMakrocyclen wurden für serumfreie Experimente aus 2 mMVorratslösungen (100% DMSO) in sterilem Wasser verdünnt,um 400 μM Arbeitslösungen herzustellen. Eine 40 μMLösung wurde dann durch 10-fache Verdünnung inAssay-Puffer hergestellt. Der Makrocyclus und die Kontrollen wurdendann seriell zweifach in Assay-Puffer in Dosierplatten verdünnt,um Konzentrationen zwischen 1,2 und 40 μM zu liefern. DieMakrocyclen wurden für Experimente in 2% Humanserum aus10 mM Vorratslösungen (100% DMSO) in sterilem Wasser verdünnt,um 1 mM Arbeitslösungen herzustellen. Eine 100 μMLösung wurde durch 10-fache Verdünnung in Assay-Pufferhergestellt. Die Makrocyclen und die Kontrollen wurden dann seriellzweifach in Assay-Puffer in Dosierplatten verdünnt, umKonzentrationen zwischen 3 und 100 μM zu liefern. 50 μLvon jeder Verdünnung wurden dann in die entsprechendenMulden der Testplatte gegeben, um Endkonzentrationen des Makrocyclus zwischen0,6 und 20 μM (für serumfreie Experimente) beziehungsweise1,5 bis 50 μM (für 2% Serum-Experimente) zu ergeben.Kontrollen beinhalteten Mulden ohne Makrocyclen, die die gleicheDMSO-Konzentration wie die Makrocyclen enthaltenden Mulden enthielten,Mulden, die 0,1% Triton X-100 enthielten, und Mulden, die keineZellen enthielten. Die Platten wurden 24 Stunden lang bei 37°Cin angefeuchteter Atmosphäre mit 5% CO2 inkubiert.Am Ende einer 24-stündigen Inkubationsperiode wurde einCellTiter-Glo Lumineszenz-Zellentwicklungsfähigkeits-Assaygemäß den Herstelleranweisungen durchgeführt(Promega, Katalog Nr. G7571), und die Lumineszenz wurde mit einemBIO-TEK Synergy HT Plattenableser abgelesen. Die Werte sind als ProzentEntwicklungsfähige aufgetragen, d. h. als Prozentsatz desNegativkontrollwerts (abgeleitet aus Zellen, die nur DMSO ausgesetztwaren). Alle Assays wurden in Zweierreihen durchgeführt.
Diefolgenden Tabellen fassen die EC50-Werte(μM) zusammen, die mit den erfindungsgemäßenpeptidomimetischen Makrocyclen in verschiedenen Zelllinien beobachtetwurden: EC50-Werte inserumfreiem MediumVerbindungMDA-MB231-MetA375PC3OVCAR8NCI-H82 (SCLC-MCL1+)SP-19,81120202,5SP-2 20 20Nichtfeststell bar 20 20SP-92,94,15,77,14,2SP-103,15,268,15,7SP-48,585204,9SP-1124,34,63,21,2SP-150,90,82,11,8Nichtfeststell barSP-230,6120,90,6SP-120,50,71,90,70,9SP-24 20 20 20 20 20SP-25110,61,40,5EC50-Werte in2% HumanserumVerbindungMDA-MB231-MetA375PC3OVCAR8SP-9Nichtfeststell barNichtfeststell bar25,518,4SP-10Nichtfeststell barNichtfeststell bar24,419,1SP-44027 50 50SP-11Nichtfeststell barNichtfeststell bar23,410,7SP-152,62,79,36,4SP-233,82,74,24SP-24 50 50 50 50SP-254,33,89,56,9SP-26 50 50 50 50EC50-Werte fürverschiedene hämatologische TumoreVerbindungJurkatSEMK2Molt-4RS4;11RajiDHL-6MM1SSP-12,5104,3 201373,5SP-2 20 20 20 20 20Nichtfeststell bar 20SP-3 20 20 20 20 20 20 20SP-91,98,114,35,72,75,5SP-101,98,21,93,551,92,5SP-41,642,21093,84,9SP-110,92,61,63,72,70,91,9SP-150,40,80,71,710,50,6SP-23-0,910,611,80,50,7SP-120,40,50,71,710,3Nichtfeststell barNichtfeststell barSP-24 20Nichtfeststell barNichtfeststell barNichtfeststell barNichtfeststell barNichtfeststell barNichtfeststell barSP-250,50,90,911,80,60,6
Beispiel 3. BrdU Zellproliferations-Assay.Auszwei unterschiedlichen Spendern isolierte hPBLs wurden mit 5 μg/mLPHA, 1 μM Ionomycin und 1 μg/mL LPS stimuliertoder nicht und mit entweder 5 oder 20 μM SP-1 in Assay-Pufferbehandelt. Als Positivkontrolle wurde 1 μM Rapamycin verwendet,um die BrdU-Inkorporation zu inhibieren. Die Zellen wurden 48 Stundenlang unter den in 17 angegebenen Bedingungeninkubiert. Die BrdU-Inkorporation wurde durch ELISA gemäß denHerstelleranweisungen bewertet (Roche, Katalognummer 11444611001).Die y-Achse in 7 zeigt OD = Extinktion (A405 nm/A492 nm.)
Beispiel 4. Wirksamkeit von peptidomimetischenMakrocyclen bei einem humanen Leukämie-Xenograft-Modell.SEMK2-LNZellen, die stabil Luciferase exprimierten, wurden wie zuvor beschriebenerzeugt (Armstrong et al. (2003) Cancer Cell 3: 173–83).6–8 Wochen alte weibliche NOD-SCID Mäuse (JacksonLaboratory) erhielten 5 × 106 SEMK2-LNZellen als Injektion in die Schwanzvene. Die Bildgebung der Tiereerfolgte wie beschrieben (Walensky et al., Science 305:1466–1470 (2004)) mit dem Xenogen In Vivo Bildgebungssystem (CaliperLife Sciences) und Ganzkörper-Biolumineszenz, die durchIntegration des Photonenstroms (Photonen/s) (Living Imaging Softwarefor Xenogen In Vivo Imaging System, Caliper Life Sciences) quantifiziertwurde. Die Bildgebung der Tiere erfolgte am 8. und 12. Tag nachder Injektion der Leukämiezellen, um Tiere mit manifesterLeukämie zu identifizieren. Am 12. Tag wurden die Tierevor Einleitung der Behandlung (Behandlungstag 1) in Kohorten mitstatistisch äquivalenter Biolumineszenz eingeteilt. DieMäuse mit Leukämie erhielten eine täglicheInjektion des peptidomimetischem Makrocyclus in 3 oder 10 mg/Kg/Tagfür 21 Tage oder 30 mg/Kg/Tag für 12 Tage in dieSchwanzvene. Die Bildgebung der Tiere erfolgte währendder Behandlung an den Tagen 1, 3, 5, 7, 9, 13 und 17, und die resultierendeTumorreduktion ist in 18 gezeigt.
Beispiel 5. Bestimmung der Imnunogenizität:6–8Wochen alte weibliche Balb/c oder KM-Mäuse wurden mit unkonjugiertemSP-1 oder SP-4 immunisiert. Vor der Immunisierung wurden Seren gewonnen,und 25 μg von jedem Peptid in D5W wurden unter Verwendungdes folgenden Immunisierungsschemas in die Schwanzvene injiziert:Seren wurden sieben Tage nach den ersten beiden Immunisierungenan den Tagen 1 und 14 sowie 14 Tage nach den dritten und vierten Immunisierungengewonnen. Die Antikörper-Titer wurden durch. indirektenELISA bestimmt. Kurz gesagt wurden Mikrotiterplatten überNacht bei 4°C mit SP-1 oder SP-3 (5 μg/ml) beschichtet.Am nächsten Tag wurden die Platten fünfmal mitPBS/0,05%Tween20 (PEST) gewaschen und mit 5% fettfreier Milch/PBSTeine Stunde lang bei 37°C geblockt, danach erneut mit PESTgewaschen. Die Anti-Seren wurden seriell verdünnt und den beschichtetenPlatten 1 Stunde lang bei 37°C zugegeben. Die Platten wurdendann ausgiebig mit PEST gewaschen und weiter 1 Stunde lang bei 37°Cmit entweder HRP-konjugiertem Anti-Maus-IgG oder IgM inkubiert undvor der Zugabe von HRP-Substrat 5 Mal mit PEST gewaschen. Die Plattenwurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, und die Reaktionwurde mit 0,5 M Oxalsäurelösung gestoppt. DieExtinktion bei 450 nm wurde mit einem ELISA-Mikroplattenableserabgelesen. Die OD-Werte wurden sowohl für Kontroll- als auchfür Anti-Seren in einer Verdünnung von 1:100 bestimmt.Die Grafiken in 20 sind als Verhältnisvon OD Anti-Seren/OD Kontrollseren aufgetragen. Ein Verhältnisunter 4 wurde als negativ angesehen.
Beispiel 6. Bestimmung der Schmelztemperatur(Tm)LyophilisiertesSP-1 wurde in ddH2O auf eine Endkonzentrationvon 50 μM gelöst. Die Tm wurdebestimmt, indem zwischen den Temperaturen von 5–95°Cdie Zirkulardichroismus-(CD)-Spektren in einem Jasco-810 Spektropolarimeterbei einer festen Wellenlänge von 222 nm bestimmt wurde.Für die Messung wurden die folgenden Parameter verwendet:Datensteigung 0,1°C; Bandbreite 1 nm und Weglänge0,1 cm, Mittelwertbildung des Signals für 16 Sekunden.Die Ergebnisse sind in 21 gezeigt.
Beispiel 7. Probenvorbereitung zur Plasmastabilitätsbestimmung:Fürex-vivo Plasmastabilitätsuntersuchungen wurden 10 μMSP-1, SP-3, SP-4 und SP-6 mit vorgeklärtem Human- und Mausplasmabei 37°C 0, 15 und 120 Minuten lang inkubiert. Am Endejeder Inkubationszeit wurden 100 μL Probe entnommen undin ein frisches ”Low Retention” Eppendorf-Röhrchenmit 300 μL eiskaltem MeOH gegeben. Die Proben wurden mit10.000 UpM zentrifugiert, der Überstand entfernt und inein frisches ”Low Retention” Eppendorf-Röhrchengegeben, worauf jeder Probe 200 μL Wasser zugefügtwurden. Die Proben wurden dann durch LC-MS/MS wie anschließendgezeigt analysiert. Die Ergebnisse sind in 22 und 23 gezeigt.
Beispiel 8. Intravenöse pharmakokinetischeAnalyse:DieIV-Dosisformulierung wurde hergestellt, indem SP-1 oder SP-4 in5% DMSO/D5W gelöst wurden, um eine 10 mg/Kg/Dosis zu erhalten.In diesen Untersuchungen wurden kanülierte männlicheCrl:CD®(SD) Ratten (7–8Wochen alt, Charles River Laboratories) verwendet. Überdie Femoralkanüle wurden intravenöse Dosen verabreicht,und die Tiere erhielten eine Dosis von 10 mL/kg per Einzelinjektion.An 10 Zeitpunkten wurde Blut für die pharmakokinetischeAnalyse abgenommen (0,0833, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12 und 24h nach Verabreichung der Dosis). Die Tiere wurden nach der letztenProbengewinnung (ohne Autopsie) getötet.
DieVollblutproben wurden 10 Minuten bei etwa 4°C zentrifugiert(etwa 1500 × g). Das Plasma wurde hergestellt und innerhalbvon 30 Minuten nach der Blutgewinnung/Zentrifugation in frischeRöhrchen überführt, die eingefroren undim Dunkeln bei etwa –70°C gelagert wurden, bissie für die LC/MS/MS-Analyse vorbereitet wurden.
DieProben wurden extrahiert, indem 10 μL 50% Ameisensäurezu 100 μL Plasma (Proben oder Standards) gegeben wurdenund anschließend 10 Sekunden lang vortexiert wurde. Eswurden 500 μL Acetonitril zugefügt, anschließend2 Minuten lang vortexiert und 10 Minuten lang bei etwa 4°Cmit 14.000 UpM zentrifugiert. Die Überstände wurdenin saubere Röhrchen überführt und imTurbovap 10 psibei 37°C eingedampft. Die Proben wurden vor der LC-MS/MS-Analysemit 100 μL 50:50 Acetonitril:Wasser rekonstituiert.
Diemaximale Plasmakonzentration (Cmax, diezum Erreichen der maximalen Plasmakonzentration benötigteZeit (tmax), die terminale Plasmahalbwertszeit(t1/2), die Fläche unter der Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve(AUC), die Clearance und das Verteilungsvolumen wurden aus den Plasmakonzentrationsdatenberechnet. Alle pharmakokinetischen Berechnungen wurden mittelsnicht-kompartimenteller Analyse mithilfe von WinNonlin Version 4.1(Pharsight Corp) durchgeführt. 24 fasstdie erhaltenen Ergebnisse zusammen.
Eswurde das folgende LC-MS/MS-Verfahren verwendet. Die verwendetenLC-MS/MS-Instrumente waren kurz gesagt ein API 365 (Applied Biosystems).Die Analysensäule war eine Phenomenex Synergi (4 μ, Polar-RP,50 mm × 2 mm), und die mobilen Phasen A (0,1% Ameisensäurein Wasser) und B (0,1% Ameisensäure in Methanol) wurdenin einer Durchflussrate von 0,4 ml/min gepumpt, um den folgendenGradienten zu erhalten: Zeit(min)%B0150,5151,5954,5954,6158,0StoppMRM: 814,0 bis 374,2 (positive Ionisierung)
Beispiel 9. FACS-Analyse zum Nachweisvon FITC-markierten peptidometischen Makrocyclen in behandelten behandeltenZellen.Zellen(z. B. Jurkat-Zellen) wurden in Suspension in RPMI1640 Medium mit2 mM L-Glutamin (Invitrogen) und supplementiert mit 10% PBS und1% Penicillin-Streptomycin kultiviert. Am Vortag des Experiments wurdenSubkulturen der Zellen angelegt, um sie in einer Phase exponentiellenWachstums zu halten. Um die Aufnahme der FITC-markierten peptidomimetischenMakrocyclen durch FACS zu analysieren, wurden exponentiell wachsendeJurkat-Zellen in einer Dichte von 1 × 106 Zellenin 0,9 ml serumfreies Medium geimpft. Die Zellen wurden sich absetzengelassen, bis die Verbindungen verdünnt wurden. Die Testverbindungenwurden in DMSO auf 2 mM Vorratslösung verdünnt,anschließend in sterilem Wasser auf 400 μM verdünnt;die weitere Verdünnung auf 100 μM erfolgte mitOptiMEM. Somit wurden dann 100 μL 100 μM FITC-markierterpeptidomimetischer Makrocyclus in entsprechende Mulden gegeben,um eine Endkonzentration von 10 μM in 1 mL Volumen zu erhalten.Die Platten wurden bis zu den angegebenen Zeitpunkten wieder in37°C, 5% CO2-Inkubatoren gestellt.Am Ende jedes Zeitpunkts wurde die Zellsuspension mit Medium verdünnt,zweimal gewaschen und 15 Minuten bei 37°C Trypsin (0,25%)ausgesetzt. Dann wurden die Zellen mit OptiMEM gewaschen und schließlichin 500 μL PBS resuspendiert. Die zelluläre Fluoreszenzwurde mit dem Beckman Coulter FACS-Instrument gemessen, das mindestens20000 Ereignisse pro Probe zählte. Die Analyse erfolgtemit Summit Version 4, Dako Colorado, Inc.
Beispiel 10. Protein-Ligand-BindungsexperimenteProtein-Ligand-Bindungsexperimentewurden nach dem folgenden repräsentativen Verfahren, dasfür ein systemweites Kontrollexperiment beschrieben ist,unter Verwendung von 1 μM SP-4 plus 5 μM Bcl-xL durchgeführt. Eine 1 μLDMSO-Aliquot einer 40 μM Vorratslösung von peptidomimetischemMakrocyclus wurde in 19 μL PBS (phosphatgepufferte Salzlösung:50 mM, pH 7,5 Phosphatpuffer enthielt 150 mM NaCl) gelöst. Dieresultierende Lösung wurde 10 Minuten lang durch wiederholtesPipettieren und Klären durch Zentrifugieren mit 10.000g gemischt. Dann wurden zu einer 4 μL Aliquote des resultierenden Überstands4 μL 10 μM BCL-xL in PBSgegeben. 8,0 μL Experimentelle Probe enthielten somit jeweils40 pmol (1,5 μg) Protein in einer Konzentration von 5,0 μMin PBS plus 1 μM peptidomimetischen Makrozyklus und 2,5%DMSO. Für jeden Konzentrationspunkt in dieser Weise hergestelltedoppelte Proben wurden 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiertund danach vor der Größenausschlusschromatographie-LC-MS-Analysevon 5,0 μL Injektionen auf 4°C gekühlt.Proben, die ein Zielprotein, Protein-Ligand-Komplexe und ungebundeneVerbindungen enthielten, wurden auf eine SEC-Säule injiziert,wo die Komplexe durch eine rasche SEC-Stufe von nicht-bindenden Komponentengetrennt wurden. Das Eluat der SEC-Säule wurde mithilfevon UV-Detektoren überwacht, um zu bestätigen,dass die früh eluierende Proteinfraktion, die im Porenvolumender SEC-Säule eluiert, von auf der Säule zurückgehaltenenungebundenen Komponenten gut getrennt wurde. Nachdem der Peak, derdas Protein und die Protein-Ligand-Komplexe enthielt, von dem primärenUV-Detektor eluierte, trat er in eine Probenschleife ein, wo eraus dem Durchflussstrom der SEC-Stufe entfernt und direkt übereinen Ventilmechanismus in das LC-MS überführtwurde. Das (M + 3H)3+ Ion von ALRN-0034wird im ESI-MS bei m/z 883,8 beobachtet, wodurch der Nachweis desProtein-Ligand-Komplexes bestätigt wird.
Beispiel 11. Experimente zur kompetitivenBindungEineMischung von Liganden in 40 μM pro Komponente wurde hergestellt,indem 2 μL Aliquote von 400 μM Vorratslösungenvon jeder der drei Verbindungen mit 14 μL DMSO kombiniertwurden. Dann wurden 1 μL Aliquote dieser Mischung mit 40 μMpro Komponente mit 1 μL DMSO-Aliquoten einer seriell verdünnten Vorratslösungvon Titrant peptidomimetischem Makrocyclus (10, 5, 2,5, ..., 0,078mM) kombiniert. Diese 2 μL Proben wurden in 38 μLPBS gelöst. Die resultierenden Lösungen wurden10 Minutenlang durch wiederholtes Pipettieren gemischt und durchZentrifugieren mit 10.000 g geklärt. Zu 4,0 μLAliquoten der resultierenden Überstände wurden4,0 μL 10 μM BCL-xL inPBS gegeben. Jede experimentelle 8,0 μL Probe enthieltsomit 40 pmol (1,5 μg) Protein in 5,0 μM Konzentrationin PBS plus 0,5 μM Ligand, 2,5% DMSO und unterschiedliche Konzentrationen(125, 62,5, ..., 0,98 μM) des Titranten peptidomimetischenMakrocyclus. Für jeden Konzentrationspunkt in dieser Weisehergestellte doppelte Proben wurden 60 Minuten lang bei Raumtemperaturinkubiert und danach vor der SEC-LC-MS-Analyse von 2,0 μLInjektionen auf 4°C gekühlt. Weitere Details zudiesen und anderen Verfahren finden sich in ”AGeneral Technique to Rank Protein-Ligand Binding Affinities and DetermineAllosteric vs. Direct Binding Site Competition in Compound Mixtures.” Annis,D. A.; Nazef, N.; Chuang, C. C.; Scott, M. P.; Nash, H. M. J. Am.Chem. Soc. 2004, 126, 15495–15503; auch in ”ALIS:An Affinity Selection-Mass Spectrometry System for the Discoveryand Characterization of Protein-Ligand Interactions” D.A. Annis, C.-C. Chuang und N. Nazef. In Mass Spectrometry in MedicinalChemistry. Bearbeitet von Wanner K, Höfner G: Wiley-VCH;2007: 121–184. Mannhold R, Kubinyi H, Folkers G (Herausgeber):Methods and Principles in Medicinal Chemistry.
Beispiel 12. Quantitative Analyse derAufnahme von FITC-markierten peptiomometischen Makrocyclen mithilfe vonFluorimetrieZellen(z. B. INA-6 oder Jurkat-Zellen) wurden in Suspension in RPMI1640Medium mit 2 mM L-Glutamin und (Invitrogen), supplementiert mit10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin sowie 1 ng/ml rekombinantenHuman IL-6-Supplements im Fall von INA-6-Zellen kultiviert. Am Vortagdes Experiments wurden Subkulturen der Zellen angelegt, um sie ineiner Phase exponentiellen Wachstums zu halten. Um die Aufnahmeder FITC-markierten peptidomimetischen Makrocyclen in Zellen zuanalysieren, wurden exponentiell wachsende Zellen in einer Dichtevon 0,5 × 106 Zellen in 0,9 mLserumfreiem Medium geimpft. Die Zellen wurden sich absetzen gelassen,bis die Verbindungen verdünnt wurden. Die Testverbindungenwurden in DMSO auf 2 mM Vorratslösung verdünnt,anschließend in sterilem Wasser auf 400 μM verdünnt;die weitere Verdünnung auf 100 μM erfolgte mitOptiMEM. Somit wurden dann 100 μL 100 μM FITC-markierterpeptidomimetischer Makrocyclus in entsprechende Mulden gegeben,um eine Endkonzentration von 10 μM in 1 mL Volumen zu erhalten. DiePlatten wurden bis zu den angegebenen Zeitpunkten wieder in 37°C,5% CO2-Inkubatoren gestellt. Bei Bedarfwurden weitere Verdünnungen der Testverbindungen ebenfallsin OptiMEM hergestellt. Am Ende jedes Zeitpunkts wurden die Zellengeerntet, zwei Mal mit RPMI, supplementiert mit FBS, gewaschen undeinmal mit PBS + 0,5% BSA gewaschen. Die pelletierten Zellen wurdenresuspendiert und 15 Minuten lang bei 37°C, 5% CO2 mit 0,25% Trypsin-EDTA inkubiert. Die Zellenwurden nach der Inkubation einmal mit serumhaltigem Medium und zweiMal mit PBS mit 0,5% BSA gewaschen. Am Ende der Wäschenwurden die Zellen mit Triton X-100 enthaltendem Zelllysepuffer vonCell Signaling Technologies lysiert. Die Fluoreszenzintensitätwurde mit einem BioTek Synergy 4 Instrument gemessen. Die Verdünnungender FITC-markierten peptidomimetischen Makrocyclen fürdie Standardkurven wurden in Zelllysepuffer durchgeführtund dienten zur quantitativen Bestimmung der Menge der peptidomimetischenMakrocyclen in Zellen. Die Analyse wurde mit der Gen 5 Softwarevon Biotek Inc. durchgeführt.
Beispiel 13. Wirksamkeit von peptidomimetischenMakrocyclen bei einem orthotopen Prostatatumormodell.DieExperimente wurden mit einer Bioware® Zelllinie(PC-3M-Luc-C6) und unter Verwendung von 5 × 106 Zellen/Maus/100 μLdurchgeführt. Es wurden insgesamt männliche 70nu/nu Mäuse verwendet (7–10 Wochen alt). Männlichenu/nu-Mäuse wurden betäubt, und es wurden Einschnitteentlang der posterioren Mittellinie ihrer Abdomen genau überder Prostata durchgeführt. Die Blase wurde zurückgezogenund leicht komprimiert, um die Prostata freizulegen. PC-3M-luc-C6Zellen (5 × 105) wurden langsamin jeden dorsalen Prostatalappen injiziert. Der Peritonealschnittwurde vernäht und die Haut geschlossen.: Nach dem operativenEingriff erhielten die Mäuse Buprenorphin (0,1 mg/kg in50 μL) subkutan. Die erste Bildgebung der Tiere erfolgte am7. Tag nach der Wundheilung. Vor Behandlungsbeginn wurden die letzten50 Mäuse basierend auf BLI in 5 Gruppen eingeteilt (10Mäuse pro Gruppe). Bei den experimentellen Mäusenerfolgten zwei Mal pro Woche beginnend am 14. Tag 2,5 Wochen langBildgebungen. Am Ende des Experiments wurden die Tumoren präpariertund gewogen. Die Tumoren wurden dann zum Schnellgefrieren in zweiStücke geschnitten und in 10% Formalin fixiert. Die Behandlungmit Testverbindung wurde begonnen, nachdem zwei stabile oder zunehmendeBiolumineszenzsignale von der Inokulationsstelle der Tumorzelleerhalten wurden. Es wurden mehrere Testgruppen verwendet: Gruppe1 (Vehikel, IV tägliche Dosierung), Gruppe 2 (Testverbindung,IV tägliche Dosierung in 10 mg/kg), Gruppe 3 (Vehikel,i. p. tägliche Dosierung), Gruppe 4 (Testverbindung, i.p. tägliche Dosierung in 10 mg/kg) und Gruppe 5 (Taxoter,IV wöchentliche Dosierung mit zwei Dosen in 30 mg/kg).Die peptidomimetischen Makrocyclen für den Test wurdenwie folgt formuliert. Es wurden nur ”Low Retention”/silikonisierteKunststoffröhrchen und Spitzen verwendet. Eine 60 mg/mLVorratslösung von jedem peptidomimetischen Makrocycluswurde hergestellt, indem 140 mg von jedem Makrocyclus in 2,3 mL100% DMSO gelöst wurden. Die Vorratslösung wurdezur täglichen Dosierung in 10 Aliquote von 0,23 mL (14mg pro Ampulle) unterteilt und bei –20°C gefrorengehalten. An jedem Dosiertag wurde eine Ampulle aufgetaut. Die Arbeitskonzentrationen(2 mg/mL) jedes Makrocyclus wurden hergestellt, indem eine Aliquoteder Vorratslösung in 6,5 mL filtersterilisierter 5% Dextroseverdünnt wurde. Die DMSO-Vorratslösung wurde tropfenweiseunter fortlaufendem Rühren in die D5W gegeben. Die Lösungwurde mit 5% Dextrose auf ein Endvolumen von 7 mL eingestellt, ohnedass die fertige gebildete Dosis filtersterilisiert wurde. Das Dosiervolumenbetrug 5 μL/g (125 μL für eine 25 g Maus).Die Dosis wurde der Maus als langsamer Bolus (über 30 Sekunden)verabreicht. 45 zeigt eine Zeitbehandlungfür das orthotope Xenograft-Modell des Prostatakrebses.Die Biolumineszenz des Prostatabereichs jedes Versuchstiers wurdegemessen und als Photonen/Sekunde angegeben. Die in vivo-Tumorwachstumskinetikenwurden grafisch dargestellt, und für wiederholte Messungenwurde Zwei-Wege-ANOVA (unter Verwendung von Zeit und Behandlungals die beiden Hauptfaktoren) verwendet. Es wurden kinetische Mausbildervon repräsentativen Mäusen aus jeder Gruppe erhalten,die in 43 gezeigt sind.
Beispiel 14. Orthotopes Xenograft-Tumormodellunter Verwendung von Eierstockkrebs (SKOV3-Luc)-Tumoren.1 × 106 SKOV3-Luc Zellen, die Glühwürmchen-Luciferasestabil exprimierten, wurden in die Ovarialbursa von betäubtenSCID-beige Mäusen (9 Wochen alt, weiblich) injiziert. DieTiere wurden wöchentlich durch Biolumineszenz-Bildgebung(BLI) überwacht. Die Behandlung mit Testverbindung wurdeinitiiert, nachdem aus der Inokulationsstelle der Tumorzelle zweistabile oder ansteigende Biolumineszenzsignale erhalten wurden (indiesem Modell bis zu 9 Wochen). Vor der Initiierung der Behandlungwurden die Behandlungstiere statistisch in Kontroll- und Behandlungsgruppenaufgeteilt (10 Mäuse/Gruppe). Die. Tiere wurden nach Bedarfdurch tägliche Injektion (IP, IV oder SK) von Testverbindung(niedrige, mittlere, hohe Dosen) und Vehikel zur Kontrolle für10, 14 und/oder 21 Tage behandelt. Die Wirksamkeit wurde bestimmt,indem die Tumorlast von mit peptidomimetischen Makrocyclus und mitVehikel als Kontrolle behandelten Tieren verglichen wurde. Das Tumorwachstum/-volumenwurde durch BLI nach IP-Injektion von 150 mg/kg D-Luciferin überwacht,und die Bildgebung erfolgte sowohl dorsal als auch ventral mit einemIVIS Bildgebungssystem. Metastatische Läsionen lassen sichdurch Abschirmung der Biolumineszenz des Primärtumors abbilden.Am Ende des Experiments wurden die Tiere auf humane Weise getötet,und der Eierstocktumor wurde präpariert, gewogen und aufdie anschließende Analyse vorbereitet.
Beispiel 15. Ortotopes Xenograft-Tumormodellunter Verwendung von Brustkrebs (MDA-MB-231-Luc)-Tumoren.1 × 106 MDA-MB-Luc Zellen, die Glühwürmchen-Luciferasestabil exprimierten, wurden in das Brustgewebe von betäubtenSCID-beige Mäusen (9 Wochen alt, weiblich) injiziert. DieTiere wurden wöchentlich durch Biolumineszenz-Bildgebung überwacht.Die Behandlung mit Testverbindung wurde begonnen, nachdem zwei stabileoder zunehmende Biolumineszenzsignale von der Inokulationsstelleder Tumorzelle erhalten wurden. Vor der Initiierung der Behandlungwurden die Behandlungstiere statistisch in Kontroll- und Behandlungsgruppenaufgeteilt (10 Mäuse/Gruppe). Die Tiere wurden nach Bedarfdurch tägliche Injektion (IP, IV oder SK) von Testverbindung(niedrige, mittlere, hohe Dosen) und Vehikel zur Kontrolle für10, 14 und/oder 21 Tage behandelt. Die Wirksamkeit wurde bestimmt,indem die Tumorlast von mit Testverbindung und mit Vehikel als Kontrollebehandelten Tieren verglichen wurde. Das Tumorwachstum/-volumenwurde durch Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) nach IP-Injektion von150 mg/kg D-Luciferin überwacht, und die Bildgebung erfolgtesowohl dorsal als auch ventral mit einem IVIS Bildgebungssystem.Metastatische Läsionen lassen sich durch Abschirmung derBiolumineszenz des Primärtumors abbilden. Am Ende des Experimentswurden die Tiere auf humane Weise getötet, und der Eierstocktumorwurde präpariert, gewogen und auf die anschließendeAnalyse vorbereitet.
Beispiel 16. Subkutanes Xenograft-Tumormodellunter Verwendung von Melanom-(A375) oder kleinzelligen Lungenkrebs-(NCI-H-82)-Tumoren.Indie Flanke von betäubten NOD/SCID- oder nu/nu-Mäusenwurde nach Bedarf durch subkutane Injektion eine optimierte Mengean Tumorzellen injiziert. Als die Tumoren ein mittleres Volumenvon 20–50 mm3 erreicht hatten,wurden die Tiere in Kontroll- und Behandlungsgruppe sortiert (10Mäuse/Gruppe). Die Tiere wurden nach Bedarf durch täglicheInjektion (IP, IV oder SK) von Testverbindung (niedrige, mittlereund hohe Dosen) und Vehikel zur Kontrolle für 10, 14 und/oder21 Tage behandelt. Die Wirksamkeit wurde bestimmt, indem das Tumorvolumenvon mit Testverbindung und mit Vehikel als Kontrolle behandeltenTieren verglichen wurde. Das Tumorwachstum/-volumen wurde durchMessung mit einem externen Messschieber (L × B × T) überwacht.Am Ende des Experiments wurden die Tiere auf humane Weise getötet,und der Tumor wurde präpariert, gewogen und auf die anschließendeAnalyse vorbereitet.
Beispiel 17. Metastatisches Tumormodellunter Verwendung von metastatischem Brustkrebs (MDA-MB-231-Met-Luc)-Tumoren.BetäubtenNOD/SCID-Mäusen (9 Wochen alt, weiblich) wurde per Injektioneine optimierte Menge an MDA-MB-213-MET-Luc-Zellen, die Glühwürmchen-Luciferasestabil exprimierten, in den linken Herzventrikel (somit direkt indas arterielle System) verabreicht. Eine erfolgreiche intrakardialeInjektion zeigt sich darin, dass in den Bildern vom nullten Tageine systemische Biolumineszenz zu erkennen ist, die sich überdie Tiere verteilt, und nur Mäuse mit festgestellter befriedigenderInjektion verbleiben in dem Experiment. Die Tiere wurden in Kontroll-und Behandlungsgruppen (10 Mäuse/Gruppe) sortiert. DieTiere wurden nach Bedarf durch tägliche Injektion (IP,IV oder SK) von Testverbindung (niedrige, mittlere und hohe Dosen)und Vehikel zur Kontrolle für 10, 14 und/oder 21 Tage behandelt.Die Entwicklung der anschließenden Metastasen wurde durchBLI nach IP-Injektion von 150 mg/kg D-Luciferin zwei Mal pro Woche überwacht,und die Bildgebung erfolgte sowohl dorsal als auch ventral mit einemIVIS Bildgebungssystem. Es wurde insbesondere auf Lungen- und Knochenmetastasen überwacht.Am Ende des Experiments wurden die Tiere auf humane Weise getötet,und interessierende Gewebe wurde präpariert und auf dieex vivo-Bildgebung und anschließende Analyse vorbereitet.
Dieobigen Tumormodelle sind detaillierter in Jenkins, D. E.et al., Clin. Exp.Metastasis. 2003, 20, 745–756.; ScatenaC. D. et al., Prostate 2004, 59, 292–303; GreenawayJ. et al., Mol. Cancer Ther. 2009, 8, 64–74; Guan,J. et al., Cancer Chemo Pharma. 2008, Online Pub Dec. 24;und Lelekakis, M. et al., Clin Exp Metastasis. 1999, 163–170,beschrieben.
Obwohlhier bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindunggezeigt und beschrieben worden sind, ist es Fachleuten offensichtlich,dass diese Ausführungsformen nur als Beispiele gegebenwerden. Fachleuten ergeben sich zahlreiche Varianten, Veränderungenund Substitutionen, ohne den Bereich der Erfindung zu verlassen.Es sei darauf hingewiesen, dass verschiedene Alternativen zu denhier beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung zurAusübung der Erfindung verwendet werden können.Es ist vorgesehen, den Schutzumfang der Erfindung durch die folgendenAnsprüche zu definieren, wodurch Verfahren und Struktureninnerhalb des Schutzumfangs dieser Ansprüche und deren Äquivalenteabgedeckt werden.
ABSTRACT DER OFFENBARUNGDievorliegende Erfindung liefert biologisch aktive peptidomimetischeMakrocyclen zur Behandlung von zellproliferativen Erkrankungen,wie Krebs und immunproliferativer Erkrankung.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNGDiese Listeder vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisierterzeugt und ist ausschließlich zur besseren Informationdes Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschenPatent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmtkeinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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